Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)

Виявлення генетичного захворювання за допомогою ПЛР - на прикладі муковісцидозу

• У досліді ПЛР застосовують, щоб виявити специфічну делецію в гені CFTR, найчастішу причину муковісцидозу. При цьому певну ділянку гена CFTR ампліфікують.
• Залежно від того, чи ця ділянка наявна повністю, чи вкороченою, продукти ПЛР різняться за довжиною: нормальна ДНК або мутована ДНК.
• Порівнявши ці довжини, можна визначити, чи людина здорова, чи є носієм, чи хворою. Отже, ПЛР уможливлює цілеспрямовану діагностику генетичних дефектів, які трапляються при муковісцидозі.

Попередні знання

Учні мають знати основні властивості ДНК. Крім того, вони мають розуміти перебіг ПЛР, зокрема три головні кроки: денатурацію, відпал і елонгацію.

Принцип

Учні виконують ПЛР і самостійно готують реакційні суміші. Перебігом ПЛР можна керувати й спостерігати за ним через застосунок miniPCR. Дані в реальному часі при цьому подаються графічно, тож учні можуть наочно уявити собі процес ПЛР. Візуалізація результатів гель-електрофорезом не є частиною цього досліду. Проте продукти ПЛР можна безпосередньо піпетувати в блок для гель-електрофорезу.

Навчальна мета

Учні мають завдяки цьому дослідові дізнатися й зрозуміти принцип дії ПЛР. При цьому вони дізнаються, як за допомогою цього методу цілеспрямовано ампліфікують ДНК.

Завдання

Учні дозують проби ДНК і реагенти для ПЛР. Для цього праймер-мікс, майстер-мікс і пробу ДНК піпетують у підписану пробірку й ретельно перемішують. Далі відбувається ПЛР у термоциклері із заданими температурними циклами денатурації, відпалу та елонгації.

Підготовка реагентів для учнів. Вийміть реагенти з морозильної шафи й доведіть до кімнатної температури. Потім піпетуйте наведені нижче реагенти згідно з поданою таблицею в підписані пластикові пробірки. Після цього проби знову заморозьте. Важливо: щоб уникнути забруднення, використовуйте для кожного додавання новий наконечник піпетки.

Радимо вам, окрім інформації для вчителів у цьому описі досліду, скористатися також інструкцією з експлуатації використовуваного набору.

• Для цього досліду діють загальні вказівки щодо безпечного експериментування на уроках природничих наук.

• Щодо H- і P-фраз, будь ласка, скористайтеся паспортом безпеки відповідного хімікату.

• Барвник SYBR-Green, який використовують у таблетках GelGreen під час гель-електрофорезу, є безпечною альтернативою звичайному етидій броміду. Він не може проникнути крізь шкіру, але може потрапити в тканини через відкриті рани. Тому радимо використовувати нітрилові рукавички.

• Агарозні гелі, виготовлені з таблеток GelGeen, можна утилізувати зі звичайними побутовими відходами.

Міс Бейкер пече пампушки

Міссі Бейкер зникла!

• Двох пекарів-суперників, Алана Торте та Бренду Біскотті, підозрюють у причетності до зникнення. Проби волосся, узяті з автомобілів обох підозрюваних, могли б збігтися з волоссям Міссі Бейкер. Ви маєте за допомогою аналізу ДНК допомогти її знайти!
• Кожна людина несе майже в кожній клітині унікальну ДНК, яка слугує носієм слідів. Ця властивість робить ДНК цінним інструментом у криміналістиці, зокрема для встановлення особи на місці злочину.
• Оскільки Міссі Бейкер хворіє на муковісцидоз, її ДНК можна однозначно виявити за специфічною делецією в гені CFTR.

• Відомо понад 1500 різних мутацій, які можуть призвести до нефункційного білка CFTR і тим самим до муковісцидозу. Найчастіша мутація - це делеція, за якої бракує ділянки нормальної послідовності ДНК.
• Залежно від того, якої частини бракує, мутація може призвести до того, що білок CFTR утворюється з помилками або не утворюється взагалі.
• Муковісцидоз - рецесивна спадкова хвороба. Це означає: людина хворіє лише тоді, коли має два дефектні гени CFTR, тобто успадкувала мутацію на обох хромосомах.

Смуги ДНК в агарозному гелі

Після завершення ПЛР виконують гель-електрофорез. При цьому фрагменти ДНК, що утворилися під час ПЛР, можна розділити й зробити видимими. Електрофорез уможливлює розділення та візуалізацію фрагментів ДНК. Для цього використовують негативний заряд нуклеїнових кислот, які в електричному полі рухаються до позитивного полюса (анода). Стаціонарною фазою слугує агарозний гель, що працює як сітка: що вища концентрація агарози в гелі, то щільніші комірки сітки. Малим фрагментам ДНК легше, ніж великим, рухатися крізь цю сітку до анода, тож із часом вони просуваються в гелі далі. Нуклеїнові кислоти самі собою в гелі не видно. Тому ми застосовуємо флуоресцентний барвник. Синє світло під камерою для електрофорезу збуджує барвник до світіння й таким чином робить ДНК видимою.

Термоциклер miniPCR

• Завантажте застосунок miniPCR для термоциклера miniPCR з App Store (для всіх мобільних пристроїв і комп'ютерів).
• Термоциклер може запрограмувати заздалегідь учитель або під час уроку - учні.
• Щойно програму запущено, miniPCR доводить її до кінця навіть тоді, коли зв'язок із пристроєм, на якому працює застосунок, переривається.
• Якщо ви хочете стежити за реакцією під час перебігу в реальному часі, термоциклер miniPCR має лишатися з'єднаним із пристроєм, на якому працює застосунок.

1. Піпетуйте реагенти для ПЛР згідно з поданою нижче таблицею в підписані пробірки. Щоб уникнути забруднення, використовуйте для кожного додавання новий наконечник.

2. Струсніть пробірку, щоб перемішати вміст. За наявності можна скористатися вортекс-мікшером.

3. Переконайтеся, що вся рідина зібралася на дні пробірки.

4. Якщо рідина пристала до стінок пробірки або до кришки, приберіть її енергійним струшуванням рукою або, якщо є мініцентрифуга, коротким центрифугуванням у мікроцентрифузі.

5. Одразу після цього переходьте до наступного розділу протоколу.

Програмування приладу для ПЛР

Запрограмуйте свій термоциклер із такими параметрами:
Початкова денатурація: 94 °C, 30 секунд
Денатурація: 94 °C, 5 секунд
Відпал: 57 °C, 5 секунд
Елонгація: 72 °C, 8 секунд
Кількість циклів: 30
Кінцева елонгація: 72 °C, 30 секунд

ПЛР триває приблизно 35 хвилин, якщо використовують термоциклер miniPCR.

Під час перебігу реакції ПЛР

1. Назвіть три головні фази ПЛР, за якими можна стежити в застосунку miniPCR.

2. Поясніть, що відбувається під час фази «Елонгація».

3. Опишіть, що показує синя крива в правому нижньому вікні програми.

4. Поясніть, як змінюється кількість ДНК упродовж ПЛР.

Спостереження за реакцією ПЛР у реальному часі за допомогою програми miniPCR®