Інформація для вчителів
Застосування
Gos d'Atura (каталонська вівчарка)
Здоровий собака має зазвичай 78 хромосом (39 пар хромосом). За винятком статевих хромосом, кожна пара несе ту саму спадкову інформацію. Проте в межах генів часто трапляються невеликі відмінності - так звані алелі, - які можуть успадковуватися або домінантно, або рецесивно. Такі генетичні варіації зумовлюють гетерозиготні генотипи й становлять індивідуальність кожного собаки. Відмінності такого роду можна цілеспрямовано використовувати для тестів на батьківство.
Під час аналізу батьківства порівнюють ДНК цуценяти з ДНК можливого батька. Важливий метод, щоб зробити відмінності в ДНК видимими, - це гель-електрофорез.
Інша інформація для вчителя (1/4)
Попередні знання
Учні мають уже бути обізнані з властивостями ДНК, знати поняття хромосома, геном, генотип, фенотип і алель та вміти їх застосовувати. Крім того, вони мають уже знати, як працює полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), і знати принцип гель-електрофорезу. Учням також варто заздалегідь потренуватися піпетувати.
Принцип
Проби ДНК кобеля (можливого батька) і цуценят (нащадків) наносять на агарозний гель і розділяють за допомогою гель-електрофорезу. Картини смуг порівнюють між собою й так визначають, чи несе цуценя цю спадкову речовину. Якщо використовують таблетки агарози SeeGreen 3-в-1, флуоресцентний барвник SYBR-Green, що міститься в таблетках, інтеркалює в ДНК. Барвник збуджується особливим світлом гелевої камери blueGel™ і в такий спосіб змушує ДНК світитися.
Інша інформація для вчителя (2/4)
Навчальна мета
Завдяки цьому дослідові учні мають ознайомитися з принципом дії гель-електрофорезу й зрозуміти його. За допомогою цього методу ДНК розділяють за розміром і роблять видимою.
Завдання
Учні готують агарозний гель заданої концентрації й наносять різні проби ДНК. За розділенням можна спостерігати наживо й самостійно документувати його камерою смартфона або планшета. Після цього учні можуть визначити, чи несуть окремі цуценята спадкову речовину кобеля.
Інша інформація для вчителя (3/4)
Зауваги щодо підготовки та виконання
Відео ліворуч показує виготовлення гелю, складання системи та приклад розділення ДНК.
Використовуючи таблетки SeeGreen, зважайте, що в таблетці вже міститься сіль ТБЕ. Жодної додаткової солі додавати не можна. До таблетки треба долити лише зазначену в інструкції кількість деіонізованої води.
Буфер для електрофорезу теж має бути ТБЕ-буфером і мати концентрацію 1x. Радимо вчителям розвести буфер заздалегідь і роздати учням аліквоти.
Прилад для електрофорезу blueGel із затемнювальним ковпаком і живим зображенням
Інша інформація для вчителя (4/4)
Варіанти експерименту та примітки
- Для закипання гелю рекомендовано скористатися мікрохвильовою піччю, але можна взяти й нагрівальну плиту.
- Дослід можна виконати й з гелями з окремих складників (агароза, ТБЕ або ТАЕ), а смуги ДНК забарвити розчином метиленового синього. Проте тоді спостерігати за розділенням у реальному часі неможливо.
- Оскільки піпетувати найменші об'єми непросто, рекомендовано заздалегідь потренувати цю процедуру з учнями.
- Якщо ви готуєте проби ДНК більш ніж за 24 години до уроку, зберігайте пробірки до використання в холодильнику.
Правила безпеки
Для цього досліду діють загальні вказівки щодо безпечного експериментування на уроках природничих наук.
Щодо H- і P-фраз звертайтеся, будь ласка, до паспорта безпеки відповідного реактиву.
Використаний у таблетках SeeGreen SYBR-Green є безпечною альтернативою звичайному етидій броміду. Він не може проникнути крізь шкіру, але може потрапити в тканини через відкриті рани. Тому радимо користуватися нітриловими рукавичками.
Агарозні гелі, що містять вміст таблеток SeeGreen, можна утилізувати зі звичайним побутовим сміттям.
Інформація для учнів
Мотивація /теорія (1/4)
Мотивація / теорія (1/4)
Молода зграя собак (Gos d'Atura, каталонська вівчарка)
Моллі, лабрадудль, здивувала тебе виводком цуценят! - але хто ж батько? На ці питання молекулярно-біологічні методи, як-от полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) і агарозний гель-електрофорез, можуть дати однозначну відповідь.
ДНК містить гени, які слугують планом побудови білків і визначають такі ознаки, як зовнішній вигляд собаки. Генотип описує генетичний набір, фенотип - видимі ознаки, на які можуть впливати й чинники довкілля. У досліді досліджують структуру шерсті на морді («furnishings»), якою керує ген RSPO2. Є два алелі: домінантний алель (F), який зумовлює формування цієї структури шерсті, і рецесивний алель (f), який не дає жодної особливої структури шерсті.
Теорія (2/4)
Щоб визначити генотип собаки, часто недостатньо спостерігати лише зовнішній вигляд. Тому виконують генетичний тест. Спершу з біологічної проби (напр. волосина або кров) виділяють ДНК. Цю ДНК примножують за допомогою ПЛР (полімеразної ланцюгової реакції). Після цього виконують аналіз гель-електрофорезом, під час якого фрагменти ДНК розділяють за довжиною. Оскільки два алелі гена RSPO2 різняться довжиною, так можна встановити, які алелі несе собака.
Теорія (3/4)
Ген RSPO2 визначає структуру шерсті в собак і має два варіанти (алелі): домінантний алель (F) із вставкою 167 пар основ, який зумовлює формування особливої структури шерсті, і рецесивний алель (f) без цієї вставки, який спричиняє відсутність особливої структури шерсті. Собаки успадковують по одному алелю від кожного з батьків. Уже однієї копії домінантного алеля (F) досить, щоб структура шерсті сформувалася. Лише собаки з двома рецесивними алелями (ff) не мають цієї структури шерсті.
Теорія (4/4)
Смуги ДНК проб собак в агарозному гелі
Гель-електрофорез - це важливий метод, щоб зробити фрагменти ДНК видимими й розділити їх за розміром.Молекули ДНК заряджені негативно, бо містять фосфатні групи. Якщо прикласти електричне поле, вони мандрують крізь гель у напрямку до плюсового полюса (анода). При цьому менші фрагменти рухаються швидше й далі, ніж більші, завдяки чому утворюється типова картина смуг. Після прогону ДНК забарвлюють, щоб смуги стали видимі. Кожна смуга відповідає ділянці ДНК певного розміру. Завдяки порівнянню картин смуг різних проб можна, напр. встановити, чи є цуценя родичем певного собаки.
Завдання
- Залий 2 % агарозний гель: зваж, що таблетка агарози вже містить агарозу, флуоресцентний барвник і сіль ТБЕ, тож треба долити лише деіонізовану воду.
- Завантаж проби ДНК у кишеньки гелю й запусти електрофорез.
- Порівняй картини смуг і спробуй визначити, чи збігається генотип цуценяти з генотипом можливого батька.
Обладнання
| Позиція | Обладнання | Артикул | Кількість |
|---|---|---|---|
| 1 | Камера для гель-електрофорезу blueGel™ із блоком живлення і вбудованим підсвічуванням | 35017-99 | 1 |
| 2 | Аналіз батьківства за ДНК-профілями, електрофорез | 15312-04 | 1 |
| 3 | SeeGreen™ Agarose Tabs™, таблетки агарози 3-в-1 для гель-електрофорезу, на 16 гелів | 35018-71 | 1 |
| 4 | Мікролітрова піпетка 2-20 мкл, автоклавована | 47141-10 | 1 |
| 5 | Наконечники для мікролітрових піпеток, 2-200 мкл, жовт., 1000 шт. | 47148-01 | 1 |
| 6 | Колба Ерленмейера, широкогорла, 100 мл | 46151-00 | 1 |
| 7 | Мірний циліндр, 100 мл | 36629-00 | 1 |
| 8 | Окремі пробірки для ПЛР, 0,2 мл, 100 шт., у пакеті | 35928-01 | 1 |
| 9 | Штатив на 8 пробірок 0,2 мл одноразових | 37652-01 | 1 |
| 10 | Буфер для електрофорезу ТБЕ, 1000 мл, 10-кратний концентрат | 35018-73 | 1 |
| 11 | Вода дистильована | 31246-81 | 1 |
| 12 | Захисні окуляри, прозорі | 39316-00 | 1 |
| 13 | Гумові рукавички, розмір 8 | 39323-00 | 1 |
| 14 | Градуйована піпетка, 25 мл | 36602-00 | 1 |
| 15 | Кульова піпетка | 36592-00 | 1 |
Складання (1/2)
- Розвести 10-кратний концентрат буфера ТБЕ деіонізованою водою до 1x (на один гель потрібно приблизно 30 мл буфера).
- Залий 2 % агарозний гель (зверни увагу також на відео 1). 2 % агарозний гель дещо важче заливати, але він краще надається для розділення менших фрагментів ДНК.
- Візьми з упаковки одну таблетку SeeGreen Agarose Tab і поклади її в колбу Ерленмеєра.
- Долий до таблетки 40 мл деіонізованої води й закип'яти все це (мікрохвильова піч або нагрівальна плита).
- Встав гелеву ванночку в платформу для заливання, а гребінець - у гелеву ванночку (гребінець лежить під платформою для заливання).
Відео: заливання гелю
Складання (2/2)
- Тепер залий 20 мл рідкого гелю у ванночку й дай гелю затвердіти (близько 10 хв). Звідси випливає, що з 40 мл рідкого гелю можна залити два гелі.
- Після охолодження гелю обережно витягни гребінець із гелю вертикально вгору.
- Постав тепер гелеву ванночку в буферну камеру базового блока.
- Налий у буферну камеру достатньо буфера ТБЕ 1x, щоб гель був укритий шаром рідини.
Гель, готовий до завантаження
Виконання (1/3)
Завантаження гелю й прогін (зверни увагу також на відео 2):
- Встанови піпетку 2 мкл – 20 мкл на 15 мкл і надінь на піпетку жовтий наконечник.
- Завантаж проби ДНК на гель у такому порядку: (див. наступний слайд). При цьому слід зважати, що для кожної проби ДНК треба надівати новий наконечник, щоб уникнути перехресного забруднення проб.
- Набери тепер піпеткою 15 мкл проби в наконечник і обережно перенеси вміст у кишеньку.
Відео: завантажити гель і запустити прогін
Виконання (2/3)
Проби ДНК
Завантаж проби на гель у такому порядку:
- Пробірка L: 15 мкл ДНК-маркера 1 ➔ доріжка 1
- Пробірка A: 15 мкл ДНК Astro ➔ доріжка 2
- Пробірка B: 15 мкл ДНК Buster ➔ доріжка 3
- Пробірка C: 15 мкл ДНК Chewy ➔ доріжка 4
- Пробірка D: 15 мкл ДНК Daisy ➔ доріжка 5
- Пробірка E: 15 мкл ДНК Elsa ➔ доріжка 6
- Пробірка F: 15 мкл ДНК Flora ➔ доріжка 7
- Пробірка G: 15 мкл ДНК Ginger ➔ доріжка 8
- Пробірка H: 15 мкл ДНК Hugo ➔ доріжка 9
Виконання (3/3)
Гель-камера з "чорною камерою" і смартфоном
Прогін гелю
- Надінь прозору кришку на базовий блок і запусти прогін натисканням кнопки «Увімк./Вимк.».
- Обережно накрий кришку затемнювальною камерою (див. також фото ліворуч).
- Натисканням кнопки «Світло» ти вмикаєш синє підсвічування й можеш тепер стежити за розділенням проб. За допомогою смартфона чи планшета ти можеш також зняти розділення на відео або задокументувати його фотографуванням.
- Приблизно через 20 хвилин розділення завершено.
Протокол
Завдання 1
Домінантний алель містить вставку 167 пар основ. Через це продукт ПЛР для (f)має довжину бл. 250 пн, а для(F)- бл. 400 пн. Смуги в гелі показують тоді генотип: одна смуга на 250 пн означає (ff), одна на 400 пн означає (FF), а дві смуги (250 і 400 пн) означають (Ff). Отже, із зображення гелю можна чітко прочитати як генотип, так і фенотип собаки. Порівняй свої результати з цією інформацією.
Смуги ДНК в агарозному гелі
Завдання 2
Питання
Завдання 3
Питання
Завдання 4
Питання
Завдання 5
Доповни правильні слова ДНК заряджена ____ і мандрує в електричному полі до ____. ДНК - це подвійна спіраль. Завдяки водневим зв'язкам парою стають ____ і тимін, а також цитозин і ____. Лабораторний метод, скорочено позначений як ____, дає змогу за короткий час примножити ділянки ДНК у мільйони разів.