Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) з власною ДНК

Світлові сигнали через очі досягають супрахіазматичного ядра (SCN) у гіпоталамусі

Циркадний годинник - це внутрішній вимірювач часу, який керує функціями організму, як-от сном, обміном речовин і виділенням гормонів, у 24-годинному ритмі. Синхронізується він переважно сонячним світлом, щоб наше тіло лишалося в злагоді з циклом дня і ночі. На клітинному рівні він ґрунтується на генетичних петлях зворотного зв'язку, які щодня регулюють активність генів. У людини головним годинником керує супрахіазматичне ядро (SCN) у головному мозку за підтримки таких генів, як Clock, BMAL1, Period і Cryptochrom.

За допомогою ПЛРцілеспрямовано ампліфікують певні ділянки ДНК, щоб зробити видимими генетичні відмінності. Завдяки цьому можна дослідити, чи пов'язані генетичні варіації з ритмом сну й неспання.

Попередні знання

Учні мають знати основні властивості ДНК. Крім того, вони мають розуміти перебіг ПЛР, зокрема три головні кроки: денатурацію, відпал і елонгацію.

Принцип

Учні виконують ПЛР і самостійно готують реакційні суміші. Перебігом ПЛР можна керувати й спостерігати за ним через застосунок miniPCR. Дані в реальному часі при цьому подаються графічно, тож учні можуть наочно уявити собі процес ПЛР. Візуалізація результатів гель-електрофорезом не є частиною цього досліду. Проте продукти ПЛР можна безпосередньо піпетувати в блок для гель-електрофорезу.

Навчальна мета

Учні мають завдяки цьому дослідові дізнатися й зрозуміти принцип дії ПЛР. При цьому вони на прикладі цього досліду дізнаються, як за допомогою ПЛР цілеспрямовано ампліфікують власну ДНК.

Завдання

Учні добувають свою ДНК зі слизової оболонки ротової порожнини і після виділення ДНК готують свої проби для ПЛР. Для цього праймер-мікс, майстер-мікс і пробу ДНК піпетують у підписану пробірку й ретельно перемішують. Далі відбувається ПЛР у термоциклері із заданими температурними циклами денатурації, відпалу та елонгації.

Радимо вам, окрім інформації для вчителів у цьому описі досліду, скористатися також інструкцією з експлуатації використовуваного набору.

• Для цього досліду діють загальні вказівки щодо безпечного експериментування на уроках природничих наук.

• Щодо H- і P-фраз, будь ласка, скористайтеся паспортом безпеки відповідного хімікату.

Чи траплявся вам колись джетлаг після далекої подорожі від дому, коли важко було заснути? Чи почуваєтеся ви зазвичай утомленими щодня в той самий час доби?

Обидва ці явища керуються вашим циркадним годинником. Циркадні годинники - це внутрішні вимірювачі часу, які регулюють фізіологію та поведінку нашого тіла в циклі, що повторюється щодня. Наш внутрішній годинник визначає, о котрій порі доби ми почуваємося
сонними, сповненими енергії чи голодними, і керує важливими функціями організму. Циркадний годинник задає в кожній клітині 24-годинний ритм через генетичний зворотний зв'язок білків, які по черзі активують і гальмують експресію генів.

Жайворонок чи сова

Ваші гени можуть впливати на те, чи ви радше жайворонок, чи сова!

Period 3 (Per3) - важливий ген циркадного годинника, який виявляє в людини генетичну різноманітність (поліморфізм). Особлива варіація, так званий варіабельний тандемний повтор (VNTR), впливає на внутрішній годинник. При цьому послідовність із 54 пар основ у гені Per3 повторюється або чотири, або п'ять разів. Ці відмінності можуть впливати на те, чи людина радше ранковий, чи вечірній тип. Чотири повтори пов'язані радше з вечірньою активністю, п'ять повторів - з ранковою.

За допомогою ПЛР цю генетичну варіацію можна зробити видимою й дослідити.

Смуги ДНК в агарозному гелі

Після завершення ПЛР виконують гель-електрофорез. При цьому фрагменти ДНК, що утворилися під час ПЛР, можна розділити й зробити видимими. Проте він не є частиною цього досліду, однак продукт ПЛР можна безпосередньо піпетувати в гель. Для цього використовують негативний заряд нуклеїнових кислот, які в електричному полі рухаються до позитивного полюса (анода). Стаціонарною фазою слугує агарозний гель, що працює як сітка: що вища концентрація агарози в гелі, то щільніші комірки сітки. Малим фрагментам ДНК легше, ніж великим, рухатися крізь цю сітку до анода, тож із часом вони просуваються в гелі далі. Нуклеїнові кислоти самі собою в гелі не видно. Тому ми застосовуємо флуоресцентний барвник. Синє світло під камерою для електрофорезу збуджує барвник до світіння й таким чином робить ДНК видимою.

Термоциклер miniPCR з компонентами набору

• Групам потрібен доступ до термоциклера miniPCR.
• Завантажте застосунок miniPCR з App Store (для всіх мобільних пристроїв і комп'ютерів).
• Прилади може запрограмувати заздалегідь учитель або під час уроку - учні.
• Щойно програму запущено, miniPCR доводить її до кінця навіть тоді, коли зв'язок із пристроєм, на якому працює застосунок, переривається.
• Якщо ви хочете стежити за реакцією під час перебігу в реальному часі, термоциклер miniPCR має лишатися з'єднаним із пристроєм, на якому працює застосунок.

Праймер-мікс, майстер-мікс та інші реагенти набору

Підготовка проб для ПЛР

1. Підпишіть нову пробірку для ПЛР на 0,2 мл своїми ініціалами, а після них "P" від PCR, і напишіть це на верхній частині бічної стінки пробірки.
2. Внесіть реагенти для ПЛР згідно з таблицею (див. наступний слайд) у відповідно підписану пробірку.
3. Закрийте кришечку на пробірці. Якщо вона закрита правильно, ви маєте відчути, як кришечка клацає.

Реагенти для ПЛР вносять у підписану пробірку згідно з поданою нижче таблицею.
Важливо: щоб уникнути забруднення, використовуйте для кожного додавання новий наконечник піпетки.

4. Струсніть пробірку, щоб перемішати вміст. За наявності можна скористатися вортекс-мікшером.

5. Переконайтеся, що вся рідина зібралася на дні пробірки.

6. Якщо рідина пристала до стінок пробірки або до кришки, приберіть її енергійним струшуванням рукою або, якщо є мініцентрифуга, коротким центрифугуванням у мікроцентрифузі.

7. Одразу після цього переходьте до наступного розділу протоколу.

Програмування приладу для ПЛР

Запрограмуйте свій термоциклер із такими параметрами:
Початкова денатурація: 94 °C, 30 секунд
Денатурація: 94 °C, 20 секунд
Відпал: 57 °C, 20 секунд
Елонгація: 72 °C, 20 секунд
Кількість циклів: 30
Кінцева елонгація: 72 °C, 60 секунд

ПЛР триває приблизно 60 хвилин, якщо використовують термоциклер miniPCR.

Під час перебігу реакції ПЛР

1. Назвіть три головні фази ПЛР, за якими можна стежити в застосунку miniPCR.

2. Поясніть, що відбувається під час фази «Елонгація».

3. Опишіть, що показує синя крива в правому нижньому вікні програми.

4. Поясніть, як змінюється кількість ДНК упродовж ПЛР.

Спостереження за реакцією ПЛР у реальному часі за допомогою програми miniPCR®