Інформація для викладачів
Опис
Тест на встановлення батьківства за допомогою системи BlueGel
Зазвичай кожна людина має 46 хромосом і, за винятком статевих хромосом (гоносом), кожна пара хромосом несе в собі одну й ту саму генетичну інформацію. Однак часто існують невеликі варіації генів, що призводить до появи гетерозиготних алелів. Індивідуальність генетичної будови кожної людини базується на цих варіаціях (виняток: однояйцеві близнюки). Ця унікальність використовується для проведення тестів на батьківство.
Для того щоб мати змогу аналізувати фрагменти ДНК і РНК, їх розділяють відповідно до їх розміру і роблять видимими за допомогою фарбування. Для цього використовується гель-електрофорез. Нуклеїнові кислоти заряджені негативно і тому рухаються в електричному полі в напрямку до позитивного полюса (анода). Порівнюючи зразки смуг можна встановити батьківство.
Набір містить лише зразки нелюдського походження і призначений для моделювання.
Додаткова інформація для викладачів (1/4)
попередні знання
Студенти вже мають бути знайомі з хромосомами, геномом, структурою генів (інтрони, екзони), а також властивостями ДНК. Крім того, вони вже мають знати, як працює полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) і знати принцип гель-електрофорезу. Студентам також слід заздалегідь практикуватися в піпетуванні.
Принцип
Зразки ДНК від "матері", "батька" і "дитини" наносять на агарозний гель і розділяють за допомогою гель-електрофорезу. Патерни смуг порівнюють між собою, щоб визначити, чи несе дитина генетичний матеріал обох батьків. При використанні таблеток GelGreen® 3-в-1 агарози флуоресцентний барвник SYBR-Green, що міститься в таблетках, інтеркалює з ДНК. Барвник збуджується спеціальним світлом гелевої камери blueGel™ і таким чином змушує ДНК світитися.
Додаткова інформація для викладачів (2/4)
Мета навчання
Під час цього експерименту студенти мають дізнатися і зрозуміти, як працює гель-електрофорез. За допомогою цього методу ДНК розділяється за розміром і стає видимою.
Завдання
Студенти готують агарозний гель заданої концентрації та наносять на нього різні зразки ДНК. Розділення можна спостерігати в реальному часі, задокументувати самостійно за допомогою камери смартфона або планшета і перенести ці дані на комп'ютер. Потім вони можуть визначити, чи є дитина генетичним спадкоємцем обох батьків.
Додаткова інформація для викладачів (3/4)
Інструкції з підготовки та виконання роботи
На відео зліва показано виготовлення гелю, збірку системи та приклад розділення ДНК.
Під час використання таблеток GelGreen зверніть увагу, що таблетка вже містить TBE-сіль. Ніякої додаткової солі додавати не потрібно. До таблетки слід додавати лише ту кількість деіонізованої води, яка вказана в інструкції.
Робочий буфер також має бути буфером TBE і мати концентрацію 1x. Викладач має заздалегідь розбавити буфер і розділити між студентами.
Знайомство з системою blueGel
Додаткова інформація для викладачів (4/4)
Варіанти експерименту та примітки
- Для кип'ятіння гелю рекомендується використовувати мікрохвильову піч (або електроплитку).
- Експеримент також можна проводити на гелях, що складаються з окремих компонентів (агароза, ТВЕ або ТАЕ), і смугах ДНК, забарвлених розчином метиленового синього. Однак тут неможливо спостерігати розділення у реальному часі.
- Оскільки піпетування - непросте завдання, рекомендується заздалегідь відпрацювати цю процедуру зі студентами за допомогою спеціальних карт, що входять до складу набору.
Інструкції з техніки безпеки
До цього експерименту застосовуються загальні інструкції щодо безпечного проведення експериментів під час викладання природничих наук.
Правила роботи з небезпечними речовинами наведено у відповідних паспортах безпеки.
Барвник SYBR-Green, який використовується в таблетках GelGreen, є безпечною альтернативою звичайному броміду етидію. Він не проникає через шкіру, але може потрапити в організм людини через відкриті рани. Тому рекомендується використовувати нітрилові рукавички.
Агарозний гель, виготовлений із таблеток GelGeen, можна утилізувати разом зі звичайними побутовими відходами.
Інформація для студентів
Мотивація (1/3)
Батько з донькою
Чи справді дитина моя? Можливо я усиновлювач? Методи молекулярної біології, такі як полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) та електрофорез в агарозному гелі, можуть дати чітку відповідь на ці питання.
Зазвичай у кожної людини 46 хромосом. По 23 походять від матері й батька. За винятком статевих хромосом (X- і Y-хромосоми), пари хромосом несуть практично однакову генетичну інформацію. Однак часто існують невеликі варіації, і тому обидва гени присутні в різних алелях. Ці невеликі відмінності в кодуванні й особливо в некодуючих областях геному призводять до індивідуальності генетичного матеріалу кожної людини (виняток: однояйцеві близнюки).
Мотивація (2/3)
Схематична діаграма поліморфної ділянки ДНК
Геном людини складається з кодувальних (екзонів) і некодуючих ділянок (інтронів). Некодуючі ділянки часто складаються з коротких послідовностей, що повторюються, і тому називаються "повторами". Розрізняють VNTRs: "Тандемні повтори зі змінним числом" (від 10 до 150 нуклеотидів) і STRs: "Короткі тандемні повтори" (від 2 до 7 нуклеотидів). Ці повтори дуже варіабельні у різних людей та ідеально підходять для створення генетичного відбитка пальця, який також можна використовувати для з'ясування родинних зв'язків, наприклад, для встановлення батьківства. Варіабельні ділянки ампліфікуються (відтворюються) за допомогою ПЛР, і тепер можуть бути візуалізовані та оцінені за допомогою гель-електрофорезу.
Мотивація (3/3)
Смуги ДНК в агарозному гелі
Гель-електрофорез дає змогу розділити ДНК і РНК та зробити їх видимими. Він використовує негативний заряд нуклеїнових кислот, які мігрують в електричному полі до позитивного полюса (анода). Стаціонарною фазою тут слугує агарозний гель, який функціонує як сітка: фаза: чим вища концентрація агарози в гелі, тим щільнішою є сітка. Маленькі фрагменти ДНК набагато легше, ніж великі, проникають через цю сітку до анода і, таким чином, з часом мігрують далі в гелі.
Самі по собі нуклеїнові кислоти в гелі не видно. Їх можна або забарвлювати розчином метиленового синього після закінчення циклу, або використовувати речовини, які інтеркалюють між основами генетичного матеріалу (накопичуються там). У цьому експерименті використовується флуоресцентний барвник, який інтеркалює з фрагментами Лямбда ДНК. Синє світло камери для електрофорезу змушує барвник світитися, і таким чином ДНК стає видимою (зелено-жовті смуги, як на фото зліва).
Завдання
- Приготуйте 1% агарозний гель: зверніть увагу, що таблетка агарози вже містить агарозу, флуоресцентний барвник і сіль TBE, тож треба додавати лише деіонізовану воду. Використовуйте інструкції щодо застосування таблеток.
- Завантажте зразки ДНК у підготовлений гель і почніть електрофорез.
- Порівняйте зразки ДНК і спробуйте визначити, чи справді випробуваний чоловік є батьком дитини.
Матеріал
| Позиція | Матеріал | Пункт №. | Кількість |
|---|---|---|---|
| 1 | blueGel Gel - камера для електрофорезу з блоком живлення та вбудованим блоком експонування | 35016-99 | 1 |
| 2 | GelGreen® Agarose Tabs™, агарозні таблетки 3-в-1, для гель-електрофорезу | 35018-71 | 1 |
| 3 | Мікролітрова піпетка 2-20 мкл, автоклавована | 47141-10 | 1 |
| 4 | Набір: Тест на батьківство за профілем ДНК методом гель-електрофорезу | KLA-530-130 | 1 |
| 5 | Наконечники для мікролітрових піпеток, 2-200 мкл, жовт., 1000 шт. | 47148-01 | 1 |
| 6 | Ложка-шпатель, нікельована сталь, l = 180 мм | 33392-00 | 1 |
| 7 | Захисні окуляри, прозорі | 39316-00 | 1 |
| 8 | Колба Ерленмейера, широкогорла, 100 мл | 46151-00 | 1 |
| 9 | Мірний циліндр, 100 мл | 36629-00 | 1 |
| 10 | Вода дистильована, 5 л | 31246-81 | 1 |
| 11 | Гумові рукавички, розмір 8 | 39323-00 | 1 |
| 12 | Пляшка лабораторна з різьбою, Duran®, 250 мл, GL 45 | 34155-00 | 1 |
| 13 | Мірний циліндр, 250 мл | 36630-00 | 1 |
| 14 | Буфер для електрофорезу TBE, 500 мл, 10-кратна концентрація | KLA-530-223 | 1 |
| 15 | Градуйована піпетка, 25 мл | 36602-00 | 1 |
| 16 | Кульова піпетка | 36592-00 | 1 |
Підготовка (1/2)
- Розбавте 10х концентрований концентрат буфера TBE до 1х деіонізованою водою (на один гель потрібно близько 30 мл буфера).
- Приготуйте 1% агарозний гель (див. також відео 1). Увага: однієї таблетки достатньо для приготування двох 1% гелів!
- Дістаньте з упаковки таблетку з агарозою GelGreen і помістіть її в колбу Ерленмейера.
- Додайте в таблетку 40 мл деіонізованої води і закип'ятіть (у мікрохвильовій печі або на електроплитці).
- Помістіть скляну ємність для гелю в платформу для заливки, а гребінець - у ємність для гелю (гребінець знаходиться під платформою для заливки). Використовуйте сторону гребінця з великими зубцями.
Відео 1: Підготовка гелю
Підготовка (2/2)
4. Тепер налийте в чашу 20 мл рідкого гелю і дайте йому затвердіти (близько 10 хвилин).
- Після того, як гель охолоне, обережно витягніть гребінець вертикально з гелю.
- Тепер помістіть ємність із гелем у буферну камеру базового блоку.
- Заповніть буферну камеру 1x TBE, щоб гель заповнив поверхню камери.
Гель, готовий до завантаження
Виконання роботи (1/2)
Завантаження і запуск гелю(див. також відео 2):
- Візьміть піпетку об'ємом 2 мкл-20 мкл на 9 мкл і встановіть на неї жовтий наконечник.
- Завантажте три зразки ДНК у гель у такому порядку.
- Лямбда-ДНК матері
- Лямбда-ДНК, дитини
- Лямбда-ДНК, потенційного батька
- Тепер аспіруйте (наберіть) 9 мкл зразка у наконечник за допомогою піпетки та обережно перенесіть вміст у комірку.
Завантаження і запуск гелю
Виконання роботи (2/2)
Гель-камера з "чорною камерою" і смартфоном
- Повторіть процедуру для кожного зразка і замінюйте наконечник після кожного зразка, щоб запобігти забрудненню зразків один одним.
Запуск гелю
- Закрийте базовий блок кришкою і увімкніть його, натиснувши кнопку "Вкл/Викл".
- Розгорніть "чорну камеру" і акуратно помістіть її на кришку (див. також фото зліва).
- Натиснувши кнопку "Світло", активуйте синє світло і слідкуйте за розділенням зразків. За допомогою смартфона або планшета задокументуйте розділення на плівці або зробіть фотографії та відео.
- Розділення завершується приблизно через 20 хвилин.
Протокол
Завдання 1
Порівняйте Ваші результати з таблицею та фотографією
Розміри фрагментів з оптимального забарвлення і розділення (задаються в парах основ, bp)
| ДНК матері | ДНК дитини | ДНК потенц. батька |
| 21.200 | 23.100 | 23.100 |
| 7.400 | 21.200 | 9.400 |
| 5.800 | 9.400 | 6.500 |
| 4.800 | 7.400 | 4.300 |
| 3.500 | 6.500 | 2.300 |
| 5.800 | 2.000 | |
| 5.600 | ||
| 4.800 | ||
| 4.300 | ||
| 3.500 | ||
| 2.300 | ||
| 2.000 |
Розкриття аналізу батьківства
Завдання 2
Питання
Завдання 3
Додайте потрібні слова в тексті ДНК ____ заряджена і мігрує в електричному полі до ____. ДНК являє собою подвійну спіраль: ____ і тимін, а також цитозин і ____ пов'язані водневими зв'язками. Область кодування ДНК називається ____, область, що не кодує, - ____. Ділянки з найбільшою мінливістю називаються ____. Процедура, що скорочено позначається ____, дає змогу реплікувати зразки сегментів ДНК.
Завдання 4
Напишіть правильні назви основ
Завдання на схемі: розташуйте підписи по місцях. Підписи: Аденін; Урацил; Гуанін; Тімін; Цитозин. Місця на схемі: 1; 2; 3; 4; 5.