Інформація для вчителів
Застосування
Генетичний відбиток за допомогою системи blueGel™. Для візуалізації смуг використовують безпечний барвник.
Порівняння послідовностей ДНК двох індивідів показує, що вони збігаються більш ніж на 99,9 %. Проте решти відмінностей досить, щоб однозначно схарактеризувати генетичний профіль кожної людини.
Через ці індивідуальні варіації аналіз ДНК, відомий як «генетичний відбиток», є центральним методом ідентифікації осіб і сьогодні незамінним інструментом сучасної криміналістики.
Учні здобувають базові знання із застосування гель-електрофорезу. При цьому фрагменти ДНК розділяють за їхнім розміром. Завдяки цьому постає картина смуг, яку можна однозначно віднести до особи.
Інша інформація для вчителя (1/4)
Попередні знання
Учні мають уже знати, що таке інтрони та екзони, а також знати властивості ДНК. Крім того, вони мають бути обізнані з принципом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), а також знати поведінку заряджених молекул в електричному полі.
Принцип
Учні отримують чотири різні проби ДНК, які імітують генетичні відбитки людей. Вони готують агарозний гель, наносять проби на гель і оцінюють результат. Якщо використовують таблетки агарози SeeGreen 3-в-1, наявний у таблетках флуоресцентний барвник SYBR-Green інтеркалює з ДНК. Барвник збуджується особливим світлом гелевої камери blueGel™ і таким чином змушує ДНК світитися.
Набір містить лише проби нелюдського походження і слугує тільки для імітації.
Інша інформація для вчителя (2/4)
Навчальна мета
Учні мають завдяки цьому дослідові дізнатися й зрозуміти принцип дії гель-електрофорезу.
Завдання
Учні готують агарозний гель заданої концентрації й наносять різні проби ДНК. За розділенням можна спостерігати наживо й документувати його за допомогою камери смартфона чи планшета.
Інша інформація для вчителя (3/4)
Зауваги щодо підготовки та виконання
Відео ліворуч показує приготування гелю, складання системи і приклад розділення ДНК.
Використовуючи таблетки SeeGreen™, зважайте, будь ласка, що в них уже міститься сіль ТБЕ. Жодної додаткової солі додавати не можна. До таблетки треба долити лише вказану в укладці кількість деіонізованої води.
Буфер для електрофорезу теж має бути ТБЕ-буфером і мати концентрацію 1x. Радимо розвести буфер заздалегідь на весь клас і видати кожній групі аліквоту, бо потрібна кожній групі кількість (близько 30 мл) відносно мала.
Система blueGel™ у дії
Інша інформація для вчителя (4/4)
Варіанти експерименту та примітки
- Для закипання гелю рекомендовано скористатися мікрохвильовою піччю, але можна взяти й нагрівальну плитку.
- Дослід можна виконати й із гелями з окремих складників (агароза, ТБЕ або ТАЕ), а смуги ДНК забарвити розчином метиленового синього. Проте спостерігати розділення в реальному часі тоді неможливо.
- Оскільки піпетувати найменші об'єми непросто, рекомендовано попрактикувати цю процедуру з ученицями й учнями заздалегідь.
- Компоненти набору слід заморожувати щонайменше за -18°C.
- Рекомендовано вивчити також інструкцію з експлуатації використовуваного набору:
Правила безпеки
Для цього досліду діють загальні вказівки щодо безпечного експериментування на уроках природничих наук.
Щодо H- і P-фраз, будь ласка, скористайтеся паспортом безпеки відповідного хімікату.
SYBR-Green, який використовують у таблетках SeeGreen™, є безпечною альтернативою звичайному етидій броміду. Крізь шкіру він проникнути не може, але може потрапити в тканини через відкриті рани. Тому радимо користуватися нітриловими рукавичками.
Агарозні гелі, виготовлені з таблеток SeeGeen, можна утилізувати зі звичайним побутовим сміттям.
Інформація для учнів
Мотивація
Чи справді J.M. є злочинцем - чи його засудили несправедливо?
Чоловіка засудили 1999 року за замах на вбивство на підставі свідчень свідків і аналізу волосся - попри брак однозначних доказів. Новий аналіз ДНК має тепер показати, чи справді J.M. винен, чи маємо судову помилку.
Оскільки більшість послідовностей ДНК в усіх людей однакові, криміналістичний аналіз зосереджується на варіабельних ділянках, так званих коротких тандемних повторах (STR). STR - це короткі повторювані послідовності, кількість яких індивідуально різниться. Порівнюючи ці STR у кількох місцях геному, складають генетичні відбитки, які уможливлюють однозначну ідентифікацію особи.
Теорія (1/5)
Схематична діаграма поліморфної ділянки ДНК
Складають генетичні відбитки. Тут порівнюють ділянки ДНК, які виявляють особливо великі індивідуальні відмінності, тобто є поліморфними. Ці ділянки містяться в інтронах і часто складаються з повторюваних послідовностей із двох або більше нуклеотидів. Кількість цих так званих повторів між індивідами варіабельна. Якщо тепер розглянути кілька таких поліморфізмів однієї людини, постає картина, унікальна для цієї особи, і тому її залучають до ідентифікації осіб. Ці варіабельні (поліморфні) ділянки ампліфікують за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) і далі роблять видимими гель-електрофорезом.
Теорія (2/5)
Короткі тандемні повтори (STR) різняться від людини до людини кількістю своїх повторів, що дає різні довжини ДНК. Оскільки кожна людина має два набори хромосом - по одному від кожного з батьків, - вона має два алелі на кожну ділянку STR. Поєднання цих алелів називають генотипом, наприклад «9,9» або «5,9», залежно від того, скільки повторів успадковано від батьків. Оскільки ці ділянки ДНК варіюють сильніше, ніж кодувальна ДНК, криміналісти використовують їх для складання ДНК-профілів. При цьому вони порівнюють кількість повторів STR у кількох місцях геному.
Теорія (3/5)
Що більше ділянок STR досліджують, то надійніше можна відрізнити осіб одне від одного. Тому в криміналістичних дослідженнях зазвичай аналізують щонайменше 20 ділянок STR. Далі STR-профілі доказів ДНК порівнюють з ДНК підозрюваного, щоб встановити можливі збіги.
Теорія (4/5)
Для ПЛР для цього використовують праймери, які зв'язуються в консервативних ділянках ліворуч і праворуч від поліморфних ділянок. Результатом є фрагменти ПЛР різної довжини. Якщо розглянути кілька таких ділянок, дістають картину, практично унікальну для кожного індивіда.
ПЛР складається з трьох кроків, які повторюють циклами:
1. Денатурація
2. Приєднання/відпал
3. Подовження/елонгація
Подвійні ланцюги ДНК розділяють нагріванням.
Праймери приєднуються до одноланцюгової ДНК.
Полімераза генерує комплементарний ланцюжок ДНК.
Теорія (5/5)
Смуги ДНК в агарозному гелі
Гель-електрофорез уможливлює розділення та візуалізацію фрагментів ДНК. Для цього використовують негативний заряд нуклеїнових кислот, які в електричному полі рухаються до позитивного полюса (анода). Стаціонарною фазою слугує агарозний гель, що працює як сітка: що вища концентрація агарози в гелі, то щільніші комірки сітки. Малим фрагментам ДНК легше, ніж великим, рухатися крізь цю сітку до анода, тож із часом вони просуваються в гелі далі.
Нуклеїнові кислоти самі собою в гелі не видно. Їх можна або після завершення прогону забарвити розчином метиленового синього, або скористатися речовинами, які інтеркалюють між основами спадкового матеріалу (вбудовуються там). У нашому досліді ми застосовуємо флуоресцентний барвник. Синє світло камери для електрофорезу збуджує барвник до світіння й таким чином робить ДНК видимою (зелено-жовті смуги, як на фото ліворуч).
Завдання
- Вилий 1%-й агарозний гель: зваж, що таблетка агарози вже містить агарозу, флуоресцентний барвник і сіль ТБЕ, тож долити треба лише деіонізовану воду.
- Завантаж проби ДНК у кишеньки гелю і запусти електрофорез.
- Порівняй проби ДНК між собою і спробуй встановити злочинця.
Обладнання
| Позиція | Обладнання | Артикул | Кількість |
|---|---|---|---|
| 1 | Камера для гель-електрофорезу blueGel™ із блоком живлення і вбудованим підсвічуванням | 35016-99 | 1 |
| 2 | Генетичний відбиток (ДНК-фінгерпринт), електрофорез | 15312-03 | 1 |
| 3 | SeeGreen™ Agarose Tabs™, таблетки агарози 3-в-1 для гель-електрофорезу, на 16 гелів | 35018-71 | 1 |
| 4 | Мікролітрова піпетка 2-20 мкл, автоклавована | 47141-10 | 1 |
| 5 | Наконечники для мікролітрових піпеток, 2-200 мкл, жовт., 1000 шт. | 47148-01 | 1 |
| 6 | Ложка-шпатель, сталь нікельована, l = 180 мм | 33392-00 | 1 |
| 7 | Захисні окуляри, прозорі | 39316-00 | 1 |
| 8 | Колба Ерленмейера, широкогорла, 100 мл | 46151-00 | 1 |
| 9 | Мірний циліндр, 100 мл | 36629-00 | 1 |
| 10 | Вода дистильована | 31246-81 | 1 |
| 11 | Гумові рукавички, розмір 8 | 39323-00 | 1 |
| 12 | Лабораторна пляшка з різьбою, Duran®, 250 мл, GL 45 | 34155-00 | 1 |
| 13 | Мірний циліндр, 250 мл | 36630-00 | 1 |
| 14 | Буфер для електрофорезу ТБЕ, 1000 мл, 10-кратний концентрат | 35018-73 | 1 |
| 15 | Градуйована піпетка, 25 мл | 36602-00 | 1 |
| 16 | Кульова піпетка | 36592-00 | 1 |
Складання (1/2)
- Розведи 10x концентрат буфера ТБЕ деіонізованою водою до 1x (на один гель потрібно близько 30 мл буфера).
- Вилий 2%-й агарозний гель (зваж на це також у відео 1). Увага: однієї таблетки вистачає на два 1%-ві гелі!
- Вийми одну таблетку SeeGreen Agarose Tab з упаковки і поклади її в колбу Ерленмеєра.
- Долий до таблетки 40 мл деіонізованої води і закип'яти обидва (мікрохвильова піч або нагрівальна плитка).
- Встав лоток для гелю в платформу для заливання, а гребінець - у лоток (гребінець лежить під платформою для заливання). Скористайся тим боком гребінця, де великі зубці.
Відео 1: заливання гелю
Складання (2/2)
4. Вилий тепер 20 мл рідкого гелю в лоток і дай гелю застигнути (прибл. 10 хв.).
- Після охолодження гелю обережно витягни гребінець із гелю вертикально вгору.
- Постав тепер лоток із гелем у буферну камеру базового блока.
- Налий у буферну камеру досить буфера для електрофорезу 1x ТБЕ, щоб гель був якраз укритий шаром.
Гель, готовий до завантаження
Виконання (1/3)
Завантаження гелю та прогін (зваж на це також у відео 2):
- Встанови піпетку на 12 мкл і надінь на піпетку наконечник.
- Завантаж чотири проби ДНК на гель у такому порядку (див. наступний слайд)
- Набери тепер піпеткою 12 мкл проби в наконечник і обережно перенеси вміст у кишеньку.
Завантажити гель і запустити прогін
Виконання (2/3)
Проби ДНК для досліду
Проби наносять у такому порядку (важливо: після кожної проби змінювати наконечник піпетки!):
● Доріжка 1: 12 мкл маркер довжин ДНК 1
● Доріжка 2: 12 мкл ДНК потерпілого
● Доріжка 3: 12 мкл ДНК J.M.
● Доріжка 4: 12 мкл доказ ДНК 1
● Доріжка 5: 12 мкл доказ ДНК 2
Виконання (3/3)
Гель-камера з "чорною камерою" і смартфоном
- Важливо: міняй наконечник після кожної проби, щоб уникнути перехресного забруднення проб.
Прогін гелю
- Надінь кришку на базовий блок і запусти прогін натисканням кнопки «Увімк./Вимк.».
- Розклади темну камеру і обережно постав її поверх кришки (див. також фото ліворуч).
- Натисканням кнопки «Світло» ти вмикаєш синє світло і можеш тепер стежити за розділенням проб «наживо». За допомогою смартфона чи планшета ти можеш також зняти розділення на відео або задокументувати фотографуванням.
- Приблизно через 20 хвилин розділення завершено.
Протокол
Завдання 1
Виявлення генетичних відбитків пальців
Порівняй свої результати з фото, зображеним ліворуч. Фото внизу показує маркер довжин ДНК із кількістю пар основ на кожній доріжці.
Завдання 2
Зістав основи з їхніми назвами
Завдання на схемі: розташуйте підписи по місцях. Підписи: Аденін; Урацил; Гуанін; Тимін; Цитозин. Місця на схемі: 1; 2; 3; 4; 5.
Завдання 3
Питання
Завдання 4
Доповни правильні слова ДНК заряджена ____ і в ____ полі рухається до ____. ДНК - це подвійна спіраль. Водневими зв'язками спаровуються ____ і тимін, а також цитозин і ____. ____ ділянки ДНК придатні для того, щоб відрізняти індивідів одне від одного. Ці варіабельні ділянки містяться переважно в ____, тоді як екзони радше консервативні. Щоб скласти повний генетичний ____, аналізують ____ варіабельних ділянок ДНК.