Інформація для викладачів
Опис
Генетичне дактилоскопування
Завдяки дуже успішним кримінальним серіалам, майже всі знайомі з терміном "генетичний відбиток пальця". Тому цей експеримент є особливо цікавим для ознайомлення учнів з темою гель-електрофорезу.
Щоб мати змогу аналізувати фрагменти ДНК і РНК, їх зазвичай розділяють за розміром і роблять видимими за допомогою фарбування. Для цього використовується гель-електрофорез. У цьому методі використовується негативний заряд нуклеїнових кислот, які переміщуються в електричному полі в напрямку позитивного полюса (анода). Фрагменти стають видимими за допомогою флуоресцентного барвника SYBR-Green і нешкідливого синього світлодіодного світла.
Додаткова інформація для викладачів (1/4)
Попередні знання
Студенти вже мають знати, що таке інтрони та екзони, а також властивості ДНК. Крім того, учні вже мають бути знайомі з принципом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), а також із поведінкою заряджених молекул в електричному полі.
Принцип
Студенти отримують чотири різні зразки ДНК, що імітують генетичні відбитки пальців людини. Студенти готують агарозний гель, наносять зразки на гель і оцінюють результат. При використанні таблеток GelGreen® 3-в-1 агарози флуоресцентний барвник SYBR-Green, що міститься в таблетках, інтеркалює з ДНК. Барвник збуджується спеціальним світлом гелевої камери blueGel™ і, таким чином, змушує ДНК світитися.
Набір містить лише зразки нелюдського походження і призначений для імітаційного моделювання.
Додаткова інформація для викладачів (2/4)
Мета навчання
Під час цього експерименту студенти мають дізнатися і зрозуміти, як працює гель-електрофорез. За допомогою цього методу ДНК розділяється за розміром і стає видимою.
Завдання
Студенти готують агарозний гель заданої концентрації та наносять на нього різні зразки ДНК. Розділення можна спостерігати в реальному часі, задокументувати самостійно за допомогою камери смартфона або планшета і перенести ці дані на комп'ютер.
Додаткова інформація для викладачів (3/4)
Інструкції з підготовки та виконання роботи
На відео зліва показано виготовлення гелю, збірку системи та приклад розділення ДНК.
Під час використання таблеток GelGreen зверніть увагу, що таблетка вже містить TBE-сіль. Ніякої додаткової солі додавати не потрібно. До таблетки слід додавати лише ту кількість деіонізованої води, яка вказана в інструкції.
Робочий буфер також має бути буфером TBE і мати концентрацію 1x. Викладач має заздалегідь розбавити буфер для всього класу і розподілити необхідну аліквоту кожній групі, оскільки кількість, необхідна кожній групі (близько 40 мл), є відносно невеликою.
Знайомство з системою blueGel
Додаткова інформація для викладачів (4/4)
Варіанти експерименту та примітки
- Для кип'ятіння гелю рекомендується використовувати мікрохвильову піч (або електроплитку).
- Експеримент також можна проводити на гелях, що складаються з окремих компонентів (агароза, ТВЕ або ТАЕ), і смугах ДНК, забарвлених розчином метиленового синього. Однак тут неможливо спостерігати розділення у реальному часі.
- Оскільки піпетування - непросте завдання, рекомендується заздалегідь відпрацювати цю процедуру зі студентами за допомогою спеціальних карт, що входять до складу набору.
- Усі компоненти можна зберігати протягом 2 місяців при кімнатній температурі. Для більш тривалого зберігання зразки ДНК слід вийняти з набору і заморозити при температурі не нижче -18°C.
Правила техніки безпеки
Інструкції з техніки безпеки
До цього експерименту застосовуються загальні інструкції щодо безпечного проведення експериментів під час викладання природничих наук.
Правила роботи з небезпечними речовинами наведено у відповідних паспортах безпеки.
Барвник SYBR-Green, який використовується в таблетках GelGreen, є безпечною альтернативою звичайному броміду етидію. Він не проникає через шкіру, але може проникати в організм людини через відкриті рани. Тому рекомендується використовувати нітрилові рукавички.
Агарозний гель, виготовлений із таблеток GelGeen, можна утилізувати разом зі звичайними побутовими відходами.
Інформація для студентів
Мотивація (1/4)
Хто є злочинцем?
Зразки матеріалів були знайдені на місці злочину. Як тепер ідентифікувати злочинця?
Генетичний матеріал усіх людей на 99,9% ідентичний. Геном людини складається з кодуючих (екзонів) і некодуючих (інтронів) ділянок. Інтрони, зокрема, дуже варіабельні у різних людей (за винятком однояйцевих близнюків). Щоб мати можливість ідентифікувати людей на основі їхньої генетичної структури, створюються генетичні відбитки пальців. Потім порівнюються ділянки ДНК, які демонструють особливо великі індивідуальні відмінності, тобто є поліморфними.
Мотивація (2/4)
Схематична діаграма поліморфної ділянки ДНК
Створюються генетичні відбитки. Потім порівнюють ділянки ДНК, які демонструють особливо великі індивідуальні відмінності, тобто є поліморфними. Ці ділянки розташовані в інтронах і часто складаються з послідовностей, що повторюються, з двох або більше нуклеотидів. Кількість цих так званих повторювань варіює від людини до людини. Якщо тепер розглянути кілька таких поліморфізмів людини, то виникає патерн, який є унікальним для цієї людини і тому використовується для ідентифікації особистості. Ці варіабельні (поліморфні) ділянки підсилюють за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), а потім роблять видимими за допомогою гель-електрофорезу.
Мотивація (3/4)
Для ПЛР використовують праймери, які зв'язуються в консервативних ділянках ліворуч і праворуч від поліморфних ділянок. В результаті виходять ПЛР-фрагменти різної довжини. Якщо розглянути кілька таких ділянок, то вийде візерунок, який є практично унікальним для кожної людини.
ПЛР складається з трьох етапів, які повторюються в циклах:
1. Денатурація
2. Приєднання / відпал
3. Розширення/ подовження
Полімераза генерує комплементарний ланцюжок ДНК.
Подвійні ланцюги ДНК розділяють нагріванням.
Праймери приєднуються до одноланцюгової ДНК.
Мотивація (4/4)
Смуги ДНК в агарозному гелі
Гель-електрофорез дає змогу розділити та візуалізувати фрагменти ДНК. Він використовує негативний заряд нуклеїнових кислот, які мігрують в електричному полі до позитивного полюса (анода). Стаціонарною фазою тут слугує агарозний гель, який функціонує як сітка: фаза: чим вища концентрація агарози в гелі, тим щільнішою є сітка. Маленькі фрагменти ДНК набагато легше, ніж великі, проникають через цю сітку до анода і, таким чином, з часом мігрують далі в гелі.
Безпосередньо нуклеїнових кислот в гелі не видно. Їх можна або забарвлювати розчином метиленового синього після завершення циклу, або використовувати речовини, які інтеркалюють між основами генетичного матеріалу (накопичуються там). У цьому експерименті використовується флуоресцентний барвник, який інтеркалює з фрагментами Лямбда ДНК. Синє світло камери для електрофорезу змушує барвник світитися, і таким чином робить ДНК видимою (зелено-жовті смуги, як на фото зліва).
Завдання
- Приготуйте 1 % агарозний гель: зверніть увагу на те, що таблетка агарози вже містить агарозу, флуоресцентний барвник і TBE-сіль, і тому треба додавати тільки деіонізовану воду. Використовуйте інструкції щодо застосування таблеток.
- Завантажте зразки ДНК у підготовлений гель і почніть електрофорез.
- Порівняйте зразки ДНК і спробуйте вирахувати злочинця.
Матеріал
| Позиція | Матеріал | Пункт №. | Кількість |
|---|---|---|---|
| 1 | blueGel Gel - камера для електрофорезу з блоком живлення та вбудованим блоком експонування | 35016-99 | 1 |
| 2 | GelGreen® Agarose Tabs™, агарозні таблетки 3-в-1, для гель-електрофорезу | 35018-71 | 1 |
| 3 | Мікролітрова піпетка 2-20 мкл, автоклавована | 47141-10 | 1 |
| 4 | Набір: Криміналістична ДНК-дактилоскопія (місце злочину) | KLA-530-120 | 1 |
| 5 | Наконечники для мікролітрових піпеток, 2-200 мкл, жовт., 1000 шт. | 47148-01 | 1 |
| 6 | Ложка-шпатель, нікельована сталь, l = 180 мм | 33392-00 | 1 |
| 7 | Захисні окуляри, прозорі | 39316-00 | 1 |
| 8 | Колба Ерленмейера, широкогорла, 100 мл | 46151-00 | 1 |
| 9 | Мірний циліндр, 100 мл | 36629-00 | 1 |
| 10 | Вода дистильована, 5 л | 31246-81 | 1 |
| 11 | Гумові рукавички, розмір 8 | 39323-00 | 1 |
| 12 | Пляшка лабораторна з різьбою, Duran®, 250 мл, GL 45 | 34155-00 | 1 |
| 13 | Мірний циліндр, 250 мл | 36630-00 | 1 |
| 14 | Буфер для електрофорезу TBE, 500 мл, 10-кратна концентрація | KLA-530-223 | 1 |
| 15 | Градуйована піпетка, 25 мл | 36602-00 | 1 |
| 16 | Кульова піпетка | 36592-00 | 1 |
Підготовка (1/2)
- Розбавте 10х концентрований концентрат буфера TBE до 1х деіонізованою водою (на один гель потрібно близько 30 мл буфера).
- Приготуйте 1% агарозний гель (див. також відео 1). Увага: однієї таблетки достатньо для приготування двох 1% гелів!
- Дістаньте з упаковки таблетку з агарозою GelGreen і помістіть її в колбу Ерленмейера.
- Додайте в таблетку 40 мл деіонізованої води і закип'ятіть (у мікрохвильовій печі або на електроплитці).
- Помістіть скляну ємність для гелю в платформу для заливки, а гребінець - у ємність для гелю (гребінець знаходиться під платформою для заливки). Використовуйте сторону гребінця з великими зубцями.
Відео 1: Підготовка гелю
Підготовка (2/2)
4. Тепер налийте в чашу 20 мл рідкого гелю і дайте йому затвердіти (близько 10 хвилин).
- Після того, як гель охолоне, обережно витягніть гребінець вертикально з гелю.
- Тепер помістіть ємність із гелем у буферну камеру базового блоку.
- Заповніть буферну камеру 1x TBE, щоб гель заповнив поверхню камери.
Гель, готовний до завантаження
Виконання роботи (1/2)
Завантаження і запуск гелю (див. також відео 2):
- Візьміть піпетку об'ємом 2 мкл-20 мкл на 7 мкл і встановіть на неї жовтий наконечник.
- Завантажте чотири зразки ДНК у гель у такому порядку.
- ДНК з місця злочину
- ДНК жертви
- ДНК підозрюваного №1
- ДНК підозрюваного №2
- Тепер аспіруйте (наберіть) 7 мкл зразка у наконечник за допомогою піпетки та обережно перенесіть вміст у комірку.
Завантаження і запуск гелю
Виконання роботи (2/2)
Гель-камера з "чорною камерою" і смартфоном
- Повторіть процедуру для кожного зразка і замінюйте наконечник після кожного зразка, щоб запобігти забрудненню зразків один одним.
Запуск гелю
- Закрийте базовий блок кришкою і увімкніть його, натиснувши кнопку "Вкл/Викл".
- Розгорніть "чорну камеру" і акуратно помістіть її на кришку (див. також фото зліва).
- Натиснувши кнопку "Світло", активуйте синє світло і слідкуйте за розділенням зразків. За допомогою смартфона або планшета задокументуйте розділення на плівці або зробіть фотографії та відео.
- Розділення завершується приблизно через 20 хвилин.
Протокол
Завдання 1
Порівняйте Ваші результати з таблицею та фотографією
Розміри фрагментів оптимального забарвлення і розділення (задаються в парах основ, bp)
| ДНК жертви | ДНК на місці злочину | ДНК підозрюваного 1 | ДНК підозрюваного 2 |
| 23.100 | 21.200 | 21.200 | 21.200 |
| 5.100 | 7.400 | 5.100 | 7.400 |
| 5.000 | 5.800 | 5.000 | 5.800 |
| 4.300 | 5.600 | 4.300 | 5.600 |
| 2.300 | 4.800 | 3.500 | 4.800 |
| 2.000 | 3.500 | 2.000 | 3.500 |
| (560) | 1.900 | ||
| (120) | 1.600 | ||
| 1.400 | |||
| (900) | |||
| (800) | |||
| (600) |
Виявлення генетичних відбитків пальців
Завдання 2
Запишіть правильні назви основ
Завдання на схемі: розташуйте підписи по місцях. Підписи: Аденін; Урацил.; Гуанін.; Тимін; Цитозин. Місця на схемі: 1; 2; 3; 4; 5.
Завдання 3
Питання
Завдання 4
Додайте потрібні слова в тексті ДНК ____ заряджена і рухається в ____ полі до ____. ДНК являє собою подвійну спіраль. ____ і тимін, а також цитозин і ____ пов'язані водневими зв'язками. ____ ділянки ДНК корисні для розрізнення людей одна від одної. Ці змінні ділянки здебільшого розташовані в ____, тоді як екзони більш консервативні. Для створення повного генетичного ____ аналізуються ____ змінні області ДНК.