Електрофорез ДНК фага лямбда в камері blueGel™

Гель-електрофорез ДНК фага лямбда із системою blueGel

Щоб можна було аналізувати фрагменти ДНК і РНК, їх стандартно розділяють за розміром і роблять видимими за допомогою забарвлення. Для цього використовують гель-електрофорез. Нуклеїнові кислоти заряджені негативно і тому рухаються в електричному полі до позитивного полюса (анода).

Тут досліджують спадковий матеріал фага лямбда - бактеріального вірусу, який уражає Escherichia coli. Лямбду відкрили ще 1950 року, і вона належить до найкраще досліджених вірусів. Її геном налічує 48.502 пари основ і від 1982 року повністю секвенований. Завдяки цьому відомо, які рестрикційні ферменти і в яких місцях розрізають, щоб утворити фрагменти визначеного розміру.

Попередні знання

Учні та учениці мають уже знати склад і властивості ДНК. Крім того, має бути відомий принцип дії рестрикційних ферментів, а також поведінка заряджених молекул в електричному полі. Також учні та учениці мають уже мати базове розуміння вірусів.

Принцип

Спадковий матеріал фага лямбда наносять на агарозний гель розрізаним і нерозрізаним і розділяють за розміром. Якщо використовують таблетки агарози SeeGreen™ 3-в-1, флуоресцентний барвник SYBR-Green, що міститься в таблетках, інтеркалює з ДНК. Барвник збуджується спеціальним світлом гелевої камери blueGel™ і в такий спосіб робить смуги ДНК видимими.

Навчальна мета

Учні та учениці мають через цей дослід пізнати й зрозуміти принцип дії гель-електрофорезу. За допомогою цього методу ДНК розділяють за розміром і роблять видимою.

Завдання

Учні та учениці готують агарозний гель заданої концентрації й наносять різні проби ДНК. Розділення можна спостерігати наживо й самостійно задокументувати за допомогою камери смартфона.

Примітки

• Оскільки піпетувати найменші об'єми непросто, рекомендовано попередньо потренувати цю процедуру з учнями.
• Фрагменти ДНК фага лямбда мають "липкі кінці" (sticky ends), і під час гель-електрофорезу можуть виникати артефакти: зліплені між собою ланцюги або й кільцеві структури, що спонтанно утворюються з фрагментів. Їх дуже просто розплавити нагріванням усіх проб ДНК до 70°C протягом 5 хвилин. Негайне охолодження льодом (або попередньо охолодженим у морозильній камері штативом для проб) запобігає повторному утворенню цих структур.
• Рекомендовано вивчити також інструкцію з експлуатації використовуваного набору:

• До цього експерименту застосовуються загальні інструкції щодо безпечного проведення експериментів під час викладання природничих наук.

• Правила роботи з небезпечними речовинами наведено у відповідних паспортах безпеки.

• Барвник SYBR-Green, який використовується в таблетках GelGreen, є безпечною альтернативою звичайному броміду етидію. Він не проникає через шкіру, але може потрапити в організм людини через відкриті рани. Тому рекомендується використовувати нітрилові рукавички.

• Агарозний гель, виготовлений із таблеток GelGeen, можна утилізувати разом зі звичайними побутовими відходами.

Капсид

лінійна дволанцюгова ДНК

Хвостовий відросток

Фібрилярні білки

Схематичне зображення фага лямбда

Віруси - захопливі та особливі структури. Хоча всі вони містять генетичний матеріал, щоб мати змогу розмножуватися, без хазяїна вони на це не здатні. Власного обміну речовин вони теж не мають. Тому їх не зараховують до живих істот, а розглядають як "близькі до життя".

Дотепер науково описано близько 11.300 видів вірусів. Проте, за оцінками, у світі існує ще кілька сотень тисяч видів вірусів. Лише у ссавцях може траплятися понад 320.000 невідкритих видів.

Аналізований тут бактеріофаг лямбда спеціалізований на бактерії E.coli, тобто для людини безпечний. Лямбду відкрили ще 1950 року і відтоді інтенсивно досліджували.

Смуги ДНК в агарозному гелі

Гель-електрофорез дає змогу розділяти й робити видимими ДНК і РНК. Використовують негативний заряд нуклеїнових кислот, які в електричному полі мігрують до позитивного полюса (анода). Нерухомою фазою тут слугує агарозний гель, який працює як сітка: що вища концентрація агарози в гелі, то дрібніші комірки сітки. Малим фрагментам ДНК легше, ніж великим, рухатися крізь цю сітку до анода, і тому з часом вони мігрують у гелі далі.

Нуклеїнові кислоти самі по собі в гелі не видно. Їх можна або після завершення пробігу зафарбувати розчином метиленового синього, або ж використати речовини, які інтеркалюють між основами спадкового матеріалу (вбудовуються там). У нашому досліді ми застосовуємо флуоресцентний барвник, який інтеркалює з фрагментами ДНК фага лямбда. Синє світло камери для електрофорезу збуджує барвник до світіння і в такий спосіб робить ДНК видимою (зелено-жовті смуги, як на фото ліворуч).

1. Залий 0,8%-й агарозний гель: зверни увагу, що таблетка агарози вже містить агарозу, флуоресцентний барвник і сіль ТБЕ, тож треба додати лише деіонізовану воду.
2. Внеси проби ДНК у кишеньки гелю і запусти електрофорез.
3. Порівняй нерозрізану ДНК фага з розщепленими фрагментами.

4. Тепер залий 20 мл рідкого гелю у ванночку і дай гелю затвердіти (приблизно 10 хв).

5. Після охолодження гелю обережно витягни гребінець із гелю вертикально вгору.

6. Тепер постав гелеву ванночку в буферну камеру базового блока.

7. Налий у буферну камеру достатньо 1x ТБЕ-буфера для електрофорезу, щоб гель був щойно вкритий. Не забагато, бо інакше розділення триватиме довше.

Гель-камера з "чорною камерою" і смартфоном

3. Пробіг гелю

• Надінь кришку на базовий блок і запусти пробіг натисканням кнопки „Увімк./Вимк.“.
• Розклади темну камеру і обережно постав її над кришкою (див. також фото ліворуч).
• Натисканням кнопки світла ти вмикаєш синє світло й можеш тепер стежити за розділенням проб. За допомогою смартфона чи планшета ти можеш також зняти розділення на відео або задокументувати фотографуванням. Щонайпізніше через 30-45 хвилин розділення завершено.

Розміри фрагментів за оптимального забарвлення та розділення (значення в парах основ [bp])

Розділення ДНК фага лямбда