Електрофорез лямбда-ДНК

Гель-електрофорез лямбда-ДНК із системою blueGel

Для того, щоб мати змогу аналізувати фрагменти ДНК і РНК, їх зазвичай розділяють за розміром і роблять видимими за допомогою фарбування. Для цього використовується гель-електрофорез. Нуклеїнові кислоти мають негативний заряд і тому в електричному полі рухаються в напрямку позитивного полюса (анода).

Тут аналізується генетичний склад вірусу Лямбда. Цей вірус було відкрито і досліджено ще в 1950 році, і він є одним із найбільш вивчених вірусів. Його "господарем" є бактерія Escherichia Coli (Кишкова паличка), і тому він також класифікується як бактеріофаг.

Генетичний матеріал вірусів порівняно невеликий (48 502 пари основ) і може бути легко візуалізований за допомогою гель-електрофорезу. Нуклеотидна послідовність відома в повному обсязі з 1982 року, що дає змогу під час перетравлення ферментами рестрикції генерувати фрагменти певних розмірів.

попередні знання

Студенти вже мають знати склад і властивості ДНК. Вони також мають знати, як працюють ферменти рестрикції та поведінку заряджених молекул в електричному полі. Студенти також повинні мати базове уявлення про віруси.

Принцип

Генетичний матеріал фаг лямбда в розрізаному і нерозрізаному вигляді наносять на агарозний гель, а потім розділяють відповідно до розміру.

При використанні таблеток агарози GelGreen® 3-в-1 флуоресцентний барвник SYBR-Green, що міститься в таблетках, інтеркалює з ДНК. Барвник збуджується спеціальним світлом гелевої камери blueGel™ і, таким чином, змушує ДНК світитися.

Мета навчання

Під час цього експерименту студенти мають дізнатися і зрозуміти, як працює гель-електрофорезна камера. За допомогою цього методу ДНК розділяється за розміром і стає видимою.

Завдання

Студенти готують агарозний гель заданої концентрації та наносять на нього різні зразки ДНК. Розділення можна спостерігати в реальному часі, самостійно задокументувати його за допомогою смартфона або планшета і перенести ці дані на комп'ютер.

Варіанти експерименту та примітки

• Експеримент також можна проводити на гелях, що складаються з окремих компонентів (агароза, ТВЕ або ТАЕ), і смугах ДНК, забарвлених розчином метиленового синього. Однак тут неможливо спостерігати розділення у реальному часі.
• Оскільки піпетування - непросте завдання, рекомендується заздалегідь відпрацювати цю процедуру зі студентами за допомогою спеціальних карт, що входять до складу набору.
• Фрагменти ДНК можуть прилипати один до одного, і під час гель-електрофорезу можуть виникати артефакти: ланцюжки, що прилипають один до одного, або кільцеві структури, що спонтанно утворюються з фрагментів. Їх можна дуже просто розділити, нагріваючи всі зразки ДНК до 68 °C протягом 5 хвилин. Негайне охолодження льодом запобігає повторному утворенню цих структур.

• До цього експерименту застосовуються загальні інструкції щодо безпечного проведення експериментів під час викладання природничих наук.

• Правила роботи з небезпечними речовинами наведено у відповідних паспортах безпеки.

• Барвник SYBR-Green, який використовується в таблетках GelGreen, є безпечною альтернативою звичайному броміду етидію. Він не проникає через шкіру, але може потрапити в організм людини через відкриті рани. Тому рекомендується використовувати нітрилові рукавички.

• Агарозний гель, виготовлений із таблеток GelGeen, можна утилізувати разом зі звичайними побутовими відходами.

Головка

Лінійна ДНК

Хвіст (відросток)

Нитки хвостового відростка

Схематичне зображення фаг лямбди

Віруси - це цікаві та особливі структури. Хоча всі вони містять генетичний матеріал, необхідний для розмноження, вони не здатні цього зробити без "господаря". Вони також не мають власного метаболізму. З цієї причини вони не вважаються живими істотами, але розглядаються як "близькі до життя".

За оцінками, в усьому світі існує від 200 000 до 600 000 вірусів, які можна класифікувати приблизно на 3000 типів. Багато вірусів володіють характеристиками господаря, які можуть розширюватися або змінюватися в процесі еволюції.

Аналізований тут бактеріофаг Лямбда спеціалізується на бактерії Eschirichia Coli (Кишкова паличка), тому не становить небезпеки для людини. Цей вірус був відкритий ще в 1950 році, і відтоді інтенсивно досліджується.

Бактеріофаг Лямбда, спеціалізується на бактерії Eschirichia coli, а це означає, що він нешкідливий для людини. Лямбда був відкритий ще в 1950 році і з тих пір інтенсивно досліджується.

Смуги ДНК в агарозному гелі

Гель-електрофорез дає змогу розділити ДНК і РНК та зробити їх видимими. Він використовує негативний заряд нуклеїнових кислот, які мігрують в електричному полі до позитивного полюса (анода). Стаціонарною фазою тут слугує агарозний гель, який функціонує як сітка: чим вища концентрація агарози в гелі, тим щільнішою є сітка. Маленькі фрагменти ДНК набагато легше, ніж великі, проникають через цю сітку до анода і, таким чином, з часом мігрують далі в гелі.

Безпосередньо нуклеїнових кислот в гелі не видно. Їх можна або забарвлювати розчином метиленового синього після завершення циклу, або використовувати речовини, які інтеркалюють між основами генетичного матеріалу (накопичуються там). У цьому експерименті використовується флуоресцентний барвник, який інтеркалює з фрагментами Лямбда ДНК. Синє світло камери для електрофорезу змушує барвник світитися, і таким чином робить ДНК видимою (зелено-жовті смуги, як на фото зліва).

1. Приготуйте 1 % агарозний гель: зверніть увагу на те, що таблетка агарози вже містить агарозу, флуоресцентний барвник і TBE-сіль, і тому треба додавати тільки деіонізовану воду. Використовуйте інструкції щодо застосування таблеток.
2. Завантажте зразки ДНК у підготовлений гель та почніть електрофорез.
3. Порівняйте нерозрізану фагову ДНК із розщепленими фрагментами.

4. Тепер налийте в чашу 20 мл рідкого гелю і дайте йому затвердіти (близько 10 хвилин).

• Після того, як гель охолоне, обережно витягніть гребінець вертикально з гелю.
• Тепер помістіть ємність із гелем у буферну камеру базового блоку.
• Заповніть буферну камеру 1x TBE, щоб гель заповнив поверхню камери.

Гель-камера з "чорною камерою" і смартфоном

• Повторіть процедуру для кожного зразка і замінюйте наконечник після кожного зразка, щоб запобігти забрудненню зразків один одним.

Запуск гелю

• Закрийте базовий блок кришкою і увімкніть його, натиснувши кнопку "Вкл/Викл".
• Розгорніть "чорну камеру" і акуратно помістіть її на кришку (див. також фото зліва).
• Натиснувши кнопку "Світло", активуйте синє світло і слідкуйте за розділенням зразків. За допомогою смартфона або планшета задокументуйте розділення на плівці або зробіть фотографії та відео.
• Розділення завершується приблизно через 20 хвилин.

Розміри фрагментів оптимального забарвлення і розділення (задаються в парах основ, bp)

Розділення Лямбда-ДНК

Напишіть назви основ