Інформація для вчителів
Застосування
Гель-електрофорез плазмідної ДНК за допомогою системи blueGel™
Щоб мати змогу аналізувати фрагменти ДНК і РНК, їх стандартно розділяють за розміром і роблять видимими забарвленням. Для розділення за розміром використовують електрофорез. Нуклеїнові кислоти заряджені негативно і тому в електричному полі рухаються в напрямку позитивного полюса (анода).
Досліджують електрофоретичне розділення фрагментів ДНК плазміди pXYZ.
Під впливом електричного поля розділяються різні за розміром шматки ДНК після того, як плазміду розрізали рестрикційними ферментами.
Інша інформація для вчителя (1/4)
Попередні знання
Учениці й учні мають уже знати склад і властивості ДНК. Крім того, має бути відомий принцип дії рестрикційних ферментів, а також поведінка заряджених молекул в електричному полі.
Принцип
Розрізану й нерозрізану плазміду ДНК наносять на агарозний гель і розділяють за розміром. Якщо використовують таблетки агарози SeeGreen™ 3-в-1, наявний у таблетках флуоресцентний барвник SYBR-Green інтеркалює з ДНК. Барвник збуджується особливим світлом гелевої камери blueGel™ і таким чином робить смуги ДНК видимими.
Інша інформація для вчителя (2/4)
Навчальна мета
Учениці й учні мають завдяки цьому дослідові дізнатися й зрозуміти принцип дії гель-електрофорезу. Побіжно вони дізнаються, як рестрикційні ферменти можна використати для аналізу молекули ДНК і як побудовані плазміди.
Завдання
Учениці й учні готують агарозний гель заданої концентрації й наносять різні проби ДНК. За розділенням можна спостерігати наживо й самостійно документувати його за допомогою камери смартфона.
Інша інформація для вчителя (3/4)
Зауваги щодо підготовки та виконання
Відео ліворуч показує приготування гелю, складання системи і приклад розділення ДНК.
Використовуючи таблетки GelGreen™, зважайте, будь ласка, що в таблетці вже міститься сіль ТБЕ. На одну таблетку треба долити лише 40 мл деіонізованої води, чого вистачає на заливання 2 гелів.
Для буфера для електрофорезу використовувати буфер ТБЕ 1x.
Для закипання гелю рекомендовано мікрохвильову піч, але можна взяти й нагрівальну плитку. Не перевищувати 60°C.
Система для електрофорезу blueGel із вбудованим світловим екраном і темною камерою
Інша інформація для вчителя (4/4)
Примітки
- Оскільки піпетувати найменші об'єми непросто, рекомендовано попрактикувати цю процедуру з учнями заздалегідь.
Плазмідна ДНК природно перебуває в кільцевій, надспіралізованій формі. Якщо її розрізати одним або кількома рестрикційними ферментами, утворюються лінійні фрагменти ДНК із так званими "sticky ends" (липкими кінцями), якщо ферменти такі створюють. Через ці "sticky ends" під час гель-електрофорезу можуть виникати артефакти: злиплі між собою ланцюги або й кільцеві структури, що спонтанно утворюються з фрагментів. Їх дуже просто розплавити нагріванням усіх проб ДНК до 70°C протягом 5 хвилин. Негайне охолодження льодом (або охолодженим у морозильній камері штативом для проб) запобігає повторному утворенню цих структур.
- Вивчіть також інструкцію з експлуатації набору:
Правила безпеки
Для цього досліду діють загальні вказівки щодо безпечного експериментування на уроках природничих наук.
Щодо H- і P-фраз, будь ласка, скористайтеся паспортом безпеки відповідного хімікату.
SYBR-Green, який використовують у таблетках SeeGreen™, є безпечною альтернативою звичайному етидій броміду. У шкіру він проникнути не може, але може потрапити в тканини через відкриті рани. Тому радимо користуватися нітриловими рукавичками.
Агарозні гелі, виготовлені з таблеток GelGeen™, можна утилізувати зі звичайним побутовим сміттям.
Інформація для учнів
Мотивація
Карта плазміди pBR322
Знання про плазміди важливі, щоб розуміти еволюцію та пристосування мікроорганізмів, боротися з антибіотикорезистентністю й уможливлювати сучасні біотехнологічні застосування. Без плазмід сьогоднішня медицина й біотехнологія були б навряд чи можливі. Поряд із фагом лямбда плазміда pBR322 - найбільш досліджувана й найуживаніша молекула ДНК.
Комерційно найуспішнішим досі застосуванням плазмід є промислове виробництво інсуліну. Ген інсуліну вбудовують у плазміду. Плазміда слугує вектором і її вводять у бактерійні клітини. Бактерії поглинають плазміду, розмножуються і за допомогою введеного гена виробляють людський інсулін у великих кількостях.
Теорія (1/6)
Плазміди - потужні інструменти генної інженерії
Що таке плазміди?
Плазміди - це малі кільцеві молекули ДНК у бактерій, які реплікуються незалежно від хромосоми. Часто вони не є життєво необхідними, проте можуть давати бактеріям переваги.
Плазміди в лабораторії
У лабораторії ми використовуємо плазміди, щоб зберігати й розмножувати важливу генетичну інформацію. Звичайними генно-інженерними методами ми можемо вставляти корисну ДНК просто в плазміди. Ці змінені плазміди можна потім вносити в бактерії або інші клітини, щоб вони розмножувалися.
Теорія (2/6)
Ці змінені плазміди можна далі вводити в бактерії або інші клітини, де вони самостійно розмножуються. Клітини використовують тоді генетичну інформацію, що міститься в плазмідах. Завдяки цьому вони здатні виробляти певні бажані речовини. Відомий приклад - виробництво людського інсуліну, який застосовують для лікування діабету.
Завдяки цьому біотехнологічному методу сьогодні можна виробляти людський інсулін у великих кількостях і високої якості.
Теорія (3/6)
Карти плазмід окреслюють найважливіші елементи ДНК
Карти плазмід дають огляд будови плазміди. Вони містять:
загальну довжину в парах основ (bp)
сайти клонування для вставляння ДНК
початок реплікації (Ori)
гени-маркери, як-от антибіотикорезистентності, для селекції
Теорія (4/6)
Рестрикційні ферменти- це молекулярні ножиці, які розрізають ДНК у цілком певних місцях. Вони розпізнають при цьому специфічну послідовність основ, зазвичай завдовжки від 4 до 8 пар основ. Кожен із цих ферментів має свою специфічну послідовність розпізнавання.
Ось кілька поширених рестрикційних ферментів і їхні сайти розпізнавання:
● Рестрикційний фермент EcoRI розрізає в сайті розпізнавання GAATTC
● BamHI розрізає всередині GGATCC
● PvuII розрізає посередині CAGCTG
Теорія (5/6)
Генні інженери використовують рестрикційні ферменти, як-от EcoRI, щоб розрізати плазмідну ДНК і завдяки цьому перевірити її ідентичність. У плазміди pXYZ, яка має два сайти розпізнавання EcoRI, після розрізання утворюються два фрагменти: фрагмент 1 200 bp (ДНК, що цікавить) і фрагмент 4 800 bp (решта плазміди). Ці фрагменти можна зробити видимими й виміряти гель-електрофорезом, щоб підтвердити, що йдеться про правильну плазміду.
Теорія (6/6)
Смуги ДНК в агарозному гелі
Гель-електрофорез уможливлює розділення та візуалізацію ДНК і РНК. Використовують негативний заряд нуклеїнових кислот, які в електричному полі рухаються до позитивного полюса (анода). Стаціонарною фазою тут слугує агарозний гель, що працює як сітка: що вища концентрація агарози в гелі, то щільніші комірки сітки. Малим фрагментам ДНК легше, ніж великим, рухатися крізь цю сітку до анода, тож із часом вони просуваються в гелі далі.
Нуклеїнові кислоти самі собою в гелі не видно. Їх можна або після завершення прогону забарвити розчином метиленового синього, або скористатися речовинами, які інтеркалюють між основами спадкового матеріалу (вбудовуються там). У нашому досліді ми застосовуємо флуоресцентний барвник, який інтеркалює з фрагментами плазмідної ДНК. Синє світло камери для електрофорезу збуджує барвник до світіння й таким чином робить ДНК видимою (зелено-жовті смуги, як на фото ліворуч).
Завдання
- Вилий 2%-й агарозний гель: зваж, що таблетка агарози вже містить агарозу, флуоресцентний барвник і сіль ТБЕ, тож долити треба лише деіонізовану воду.
- Завантаж проби ДНК у кишеньки гелю і запусти електрофорез.
- Порівняй нерозрізану плазміду з розрізаною.
Проби з набору: маркер довжин ДНК, нерозщеплена плазмідна ДНК, три різні розщеплення плазмідної ДНК
Обладнання
| Позиція | Обладнання | Артикул | Кількість |
|---|---|---|---|
| 1 | Камера для гель-електрофорезу blueGel™ із блоком живлення і вбудованим підсвічуванням | 35017-99 | 1 |
| 2 | Плазмідна ДНК бактерій у гель-електрофорезі | 15312-01 | 1 |
| 3 | Мікролітрова піпетка 2-20 мкл, автоклавована | 47141-10 | 1 |
| 4 | Наконечники для мікролітрових піпеток, 2-200 мкл, жовт., 1000 шт. | 47148-01 | 1 |
| 5 | Захисні окуляри, прозорі | 39316-00 | 1 |
| 6 | Колба Ерленмейера, широкогорла, 100 мл | 46151-00 | 1 |
| 7 | Мірний циліндр, 100 мл | 36629-00 | 1 |
| 8 | Вода дистильована | 31246-81 | 1 |
| 9 | Гумові рукавички, розмір 8 | 39323-00 | 1 |
| 10 | Окремі пробірки для ПЛР, 0,2 мл, 100 шт., у пакеті | 35928-01 | 1 |
| 11 | Штатив на 8 пробірок 0,2 мл одноразових | 37652-01 | 1 |
| 12 | SeeGreen™ Agarose Tabs™, таблетки агарози 3-в-1 для гель-електрофорезу, на 16 гелів | 35018-71 | 1 |
| 13 | Буфер для електрофорезу ТБЕ, 1000 мл, 10-кратний концентрат | 35018-73 | 1 |
| 14 | Градуйована піпетка, 25 мл | 36602-00 | 1 |
| 15 | Кульова піпетка | 36592-00 | 1 |
Складання (1/2)
- Розвести 10x концентрат буфера ТБЕ деіонізованою водою до 1x (на один гель потрібно близько 20 мл буфера).
- Вилий 2%-й агарозний гель (зваж на це також у відео 1).
- Вийми одну таблетку GelGreen™ Agarose Tab з упаковки і поклади її в колбу Ерленмеєра.
- Долий до таблетки 40 мл деіонізованої води і закип'яти обидва (мікрохвильова піч або нагрівальна плитка). При цьому не перевищувати 60°C.
- Поклади лоток для гелю в платформу для заливання, а гребінець - у лоток (гребінець лежить під платформою для заливання). Скористайся тим боком гребінця, де великі зубці.
Відео: заливання гелю
Складання (2/2)
4. Вилий тепер 20 мл рідкого гелю в лоток і дай гелю застигнути (прибл. 10 хв.).
5. Після охолодження гелю обережно витягни гребінець із гелю вертикально вгору.
6. Постав тепер лоток із гелем у буферну камеру базового блока.
7. Налий у буферну камеру досить буфера для електрофорезу 1x ТБЕ, щоб гель був якраз укритий шаром. Не забагато, бо інакше розділення триватиме довше.
Гель, готовий до завантаження
Виконання (1/2)
Завантаження гелю та прогін (зваж на це також у відео ліворуч):
1. Встанови піпетку 2 мкл – 20 мкл на 10 мкл і надінь на піпетку жовтий наконечник.Важливо: бери для кожної проби новий наконечник.
2. Завантаж проби ДНК на гель у такому порядку:
Плазмідна ДНК (пробірка P)
Розщеплення BamHI (пробірка B)
Розщеплення ApaLI (пробірка A)
Подвійне розщеплення (пробірка D)
Маркер довжин ДНК 3K (пробірка L)
Відео: завантажити гель і запустити прогін
Виконання (2/2)
Виконання
Гель-камера з "чорною камерою" і смартфоном
3. Прогін гелю
- Надінь кришку на базовий блок і запусти прогін натисканням кнопки «Увімк./Вимк.».
- Розклади темний ковпак і обережно постав його поверх кришки (див. також фото ліворуч).
- Натисканням кнопки світла ти вмикаєш синє світло і можеш тепер стежити за розділенням проб. За допомогою смартфона чи планшета ти можеш також зняти розділення на відео або задокументувати фотографуванням. Щонайпізніше через 30-45 хвилин розділення завершено.
Протокол
Завдання 1
Порівняйте свої результати зі зображеним фото і заповніть подану нижче таблицю рестрикційними фрагментами, що утворилися, та їхніми розмірами:
Розміри фрагментів за оптимального забарвлення й розділення (подано в парах основ [bp])
Разділення ДНК плазміди
Завдання 2
Питання
Завдання 3
Питання
Завдання 4
Питання
