Електрофорез плазмідної ДНК

Гель-електрофорез плазмідної ДНК

Плазміди ідеально підходять для вивчення того, як працює гель-електрофорез. В експерименті досліджують 4 зразки ДНК плазміди pBR322. В одному зразку плазміда присутня в нерозрізаному вигляді: у формі ссс (ковалентно замкнуте суперскручене кільце) та у формі ос (відкрите кільце). У зразках плазміда була розщеплена різними ферментами рестрикції:

• EcoRI (господар - кишкова палаичка (Escherichia coli), виробляє "липкі кінці" на 5'-G AATTC-3' - розрізи на одній ділянці, утворюючи відкриту кільцеву форму плазміди);.
• HinfI (господар - паличка інфлюенци (Haemophilus influenzae), продукує "липкі кінці" на 5'-G ANTC-3');
• HaeIII (господар - гемофільна паличка (Haemophilus egyptius), продукує гладкі кінці при 5'-GG CC-3').

У результаті виходить різна кількість фрагментів різної довжини, які можна візуалізувати за допомогою гель-електрофорезу.

Попередні знання

Студенти вже мають знати молекулярну структуру та властивості ДНК. Крім того, вони також повинні мати базові знання про бактерії і знати, як працюють ферменти рестрикції та бути знайомі з поведінкою заряджених молекул в електричному полі.

Принцип

Плазміди та фрагменти плазмід розділяють за розміром в агарозному гелі. При використанні таблеток агарози GelGreen® 3-в-1 флуоресцентний барвник SYBR-Green, що міститься в таблетках, інтеркалюється з ДНК. Барвник освітлюється (збуджується) спеціальним світлом електрофорезної камери і, таким чином, змушує ДНК світитися.

Мета навчання

Під час цього експерименту студенти мають дізнатися і зрозуміти, як працює гель-електрофорезна камера. За допомогою цього методу ДНК розділяється за розміром і стає видимою.

Завдання

Студенти готують агарозний гель заданої концентрації та розміщують у ньому різні зразки ДНК. Розділення можна спостерігати наживо, задокументувати самостійно за допомогою камери смартфона або планшета, а також перенести на комп'ютер.

Варіанти експерименту та примітки

• Для кип'ятіння гелю рекомендується використовувати мікрохвильову піч (або електроплитку).
• Експеримент також можна проводити на гелях, що складаються з окремих компонентів (агароза, ТВЕ або ТАЕ), і смугах ДНК, забарвлених розчином метиленового синього. Однак тут неможливо спостерігати розділення у реальному часі.
• Оскільки піпетування - непросте завдання, рекомендується заздалегідь відпрацювати цю процедуру зі студентами за допомогою спеціальних карт, що входять до складу набору.

• До цього експерименту застосовуються загальні інструкції щодо безпечного проведення експериментів під час викладання природничих наук.

• Правила роботи з небезпечними речовинами наведено у відповідних паспортах безпеки.

• Барвник SYBR-Green, який використовується в таблетках GelGreen, є безпечною альтернативою звичайному броміду етидію. Він не проникає через шкіру, але можепотрапити в організм людини через відкриті рани. Тому рекомендується використовувати нітрилові рукавички.

• Агарозний гель, виготовлений із таблеток GelGeen, можна утилізувати разом зі звичайними побутовими відходами.

Резистентні бактерії

Практично впродовж усього нашого життя ми оточені бактеріями і навіть живемо в симбіозі з деякими з них. Щоб швидко адаптуватися до навколишнього середовища, бактерії мають плазміди. Це кільцеподібні молекули ДНК, які зустрічаються в природі у бактерій та археях, але рідко трапляються в еукаріотах (на хлібопекарських дріжджах). Плазміди мають розмір від 1000 до 1 000 000 пар основ, містять послідовності ДНК, що дає змогу використовувати транскрипційні комплекси клітин-господарів і реплікувати їх самостійно. Клітина може містити кілька різних плазмід, а також кілька копій однієї й тієї самої плазміди. У цьому контексті плазміди можуть містити кілька генів і реплікуватися автономно. Генетична інформація про плазміди дає господарям еволюційні переваги, такі як стійкість до антибіотиків або створення нових джерел їжі. Клітини-господарі мають еволюційні переваги перед іншими бактеріями і тому можуть краще розмножуватися. Бактерії та плазміди живуть у симбіозі. Якщо плазміда має недоліки, це може призвести до загибелі клітини-господаря.

Завдяки своїм властивостям, плазміди також використовуються в біотехнологіях і дослідженнях. Щоб отримати плазміду потрібного розміру, необхідно вирізати потрібні гени (послідовності ДНК) і зібрати їх у плазміду за певним планом. У цьому процесі допомагають ферменти рестрикції, тобто білки, які можуть розрізати ДНК.

Різні ферменти рестрикції існують у всіх живих організмах. Ферменти, які підходять для цього процесу, вибираються таким чином, щоб ДНК була розрізана точно в конкретному місці. Деякі ферменти в одній точці гладко розрізають обидві нитки ДНК, а деякі розрізають їх зі зсувом, створюючи "липкі кінці", які сприяють повторному збиранню плазміди.

Схематичне зображення плазміди pBR322

Деякі ліки синтезуються за допомогою генної інженерії

Молекули ДНК, введені плазмідами, змушують бактерії виробляти речовини, необхідні людині. При цьому плазміда може залишатися в клітині-господаря в якості плазміди - а ще краще: бути включеною в її геном за допомогою певних вбудованих послідовностей ДНК. Тоді як перенесення плазміди в дочірні клітини не визначено, а перенесення з бактеріальної ДНК не викликає сумнівів. Таким чином, в даний час можна отримати близько 140 різних препаратів, таких як інсулін (проти діабету), гормони (лікування порушень росту) або ферменти (проти муковісцидозу).

1. Приготуйте 1,5 % агарозний гель: зверніть увагу на те, що таблетка агарози вже містить агарозу, флуоресцентний барвник і TBE-сіль, і тому треба додавати тільки деіонізовану воду. Використовуйте інструкції щодо застосування таблеток.
2. Завантажте зразки ДНК у підготовлений гель і почніть електрофорез.
3. Порівняйте малюнок смуг розрізаної плазміди з аналогічним малюнком смуг нерозрізаної плазміди.

4. Тепер налийте в чашу 20 мл рідкого гелю і дайте йому затвердіти (близько 10 хвилин).

• Після того, як гель охолоне, обережно витягніть гребінець вертикально з гелю.
• Тепер помістіть ємність із гелем у буферну камеру базового блоку.
• Заповніть буферну камеру 1x TBE таким чином, щоб гель заповнив поверхню камери.

Гель-камера з "чорною камерою" і смартфоном

• Повторіть процедуру для кожного зразка і замінюйте наконечник після кожного зразка, щоб запобігти забруднення зразків один одним.

Запуск гелю

• Закрийте базовий блок кришкою і увімкніть його, натиснувши кнопку "Вкл/Викл".
• Розгорніть "чорну камеру" і акуратно помістіть її на кришку (див. також фото зліва).
• Натиснувши кнопку "Світло", активуйте синє світло і слідкуйте за розділенням зразків. За допомогою смартфона або планшета задокументуйте розділення на плівці або зробіть фотографії та відео.
• Розділення завершується приблизно через 20 хвилин.

Разділення ДНК плазміди

Напишіть назви основ