Загальна інформація
Застосування
Мембранний фільтр
Кількість мікроорганізмів (КУО) - це число життєздатних мікроорганізмів в одному мілілітрі або грамі досліджуваного матеріалу, напр. води, ґрунту, молока, морозива тощо. Вона має велике практичне значення для аналізу питної води, ґрунту та харчових продуктів. Кількість мікроорганізмів можна визначити точно лише тоді, коли всі пов'язані з цим роботи виконують так, щоб досліджуваний матеріал не міг забруднитися сторонніми мікроорганізмами.
Інша інформація (1/4)
Попередні знання
Учні мають знати, які групи мікроорганізмів існують, де вони трапляються і як можуть передаватися. Добре також, якщо вони вже знають якийсь метод підрахунку мікроорганізмів.
Принцип
Стерильна робота має вирішальне значення для визначення кількості мікроорганізмів.
Інша інформація (2/4)
Навчальна мета
Учні мають здобути знання про те, як визначають кількість мікроорганізмів у пробі.
Завдання
Учні мають визначити кількість мікроорганізмів у пробі.
Інша інформація (3/4)
Щодо отримання й тлумачення результатів (1/2)
Протягом трьох-чотирьох днів на поживних середовищах розвиваються численні колонії мікроорганізмів. Колонії на кожному диску підраховують, множать це значення на обернену величину відповідного коефіцієнта розведення й визначають кількість мікроорганізмів, тобто число життєздатних мікроорганізмів в одному грамі або мілілітрі матеріалу проби. Матеріал проби розводять, щоб отримати на поживному середовищі ідеальну для підрахунку кількість колоній. Якщо через надто сильне розведення їх занадто мало, результати статистично недостатньо надійні для порівняльних досліджень. Якщо ж через недостатнє розведення колоній забагато, їх не вдається досить добре підрахувати. Тому виготовляють чашки з двома сусідніми ступенями розведення.
Інша інформація (4/4)
Щодо отримання й тлумачення результатів (2/2)
Щоб краще встановити результати, для кожного ступеня треба виготовити щонайменше дві чашки. Чашки з густим ростом мікроорганізмів легше підраховувати, якщо знизу на зовнішньому боці чашки поділити її жировим олівцем на кілька секторів і підрахувати сектори окремо. Метод розливу на чашках за Кохом передбачає дві умови: по-перше, що всі мікроорганізми у використаних розведеннях наявні як окремі одиниці, і по-друге, що кожен життєздатний мікроорганізм на використаному поживному середовищі справді росте й таким чином утворює придатну до підрахунку колонію. Оскільки це справджується не для кожного наявного життєздатного мікроорганізму, результати паралельних дослідів часто досить помітно різняться. Отримані в такий спосіб значення здебільшого дещо занижені. Попри ці вади, метод розливу на чашках за Кохом і досі є одним із найуживаніших методів визначення кількості мікроорганізмів, бо точніших методів визначення наразі немає.
Правила безпеки
Для цього досліду діють загальні вказівки щодо безпечного експериментування на природничих лабораторних заняттях.
Теорія
Історія мікроорганізмів починається з винайдення мікроскопа на початку XVII століття. Згодом Луї Пастер запровадив перші важливі методи роботи з бактеріями. Роберт Кох зробив методи мікробіології придатними для медицини. Його методи - основа сучасної мікробіологічної роботи, наприклад використання агару.
Мета цього досліду - здобути основні знання для роботи з мікроорганізмами.
Оскільки мікроорганізми чіпляються майже до всього, що ми можемо знайти, у цьому досліді ми розглядаємо мембранний метод визначення кількості мікроорганізмів.
Оснащення
Налаштування та перебіг
Складання та хід роботи (1/10)
Обпалювання шпателя
Стерильний відбір досліджуваного матеріалу
\Пробу ґрунту можна відібрати стерильно, наповнивши достатню кількість ґрунту стерильним шпателем, ложкою або замазковим ножем у широкогорлу пляшку з притертим корком, яку простерилізували в сушильній шафі гарячим повітрям. Простерилізуйте шпатель, ложку або лопатку безпосередньо перед відбором проби на місці відбору, занурюючи його приблизно на хвилину в 96 % етиловий спирт і проводячи крізь полум'я газового пальника. Під час відбору інших, нерідких проб матеріалу (напр., морозива) чинять так само. Для стерильного відбору проби води стерильну широкогорлу пляшку з притертим корком занурюють у воду на місці відбору, знімають корок, дають потрібній кількості води затекти в пляшку й знову вставляють корок під водою. Інший рідкий матеріал можна перенести стерильною піпеткою в стерильну пляшку відповідного розміру з притертим корком або влити в пляшку. Визначення кількості мікроорганізмів слід виконувати якомога швидше після відбору проби.
Складання та хід роботи (2/10)
Розведення проб
Метод розливу на чашках за Кохом
Цей метод запровадив у бактеріологічну техніку Роберт Кох. Це найдавніший, але й досі найуживаніший метод визначення кількості мікроорганізмів. Відбирають - за стерильних умов - 1 г або 1 мл досліджуваного матеріалу, зібраного в стерильну посудину, і змішують його з 9 мл стерильної дистильованої води. Якщо досліджуваний матеріал твердий, напр. проба ґрунту, то зважують 1 г його на тарованому годинниковому склі, попередньо простерилізованому в полум'ї газового пальника, і вносять цю кількість у пробірку з 9 мл стерильної дистильованої води. Переносьте пробу ґрунту за допомогою металевого шпателя, простерилізованого в полум'ї газового пальника й після цього охолодженого. Якщо досліджуваний матеріал рідкий, напр. проба води, молоко чи лимонад, то 1 мл проби переносять стерильною мірною піпеткою (див. P4140100) у пробірку з 9 мл стерильної дистильованої води.
Виходячи з цього розведення 1:10, готують подальші розведення 1:10, багаторазово піпетуючи за стерильних умов 1 мл останнього розведення в нову пробірку з 9 мл стерильної дистильованої води.
Складання та хід роботи (3/10)
Розведення та змішування проб
Проби ґрунту, у яких очікується радше висока кількість мікроорганізмів, напр. садова цвіль, розводять до 1:100 000 або 1:1 000 000, а піщані ґрунти - лише до 1:1000 або 1:10 000. Після того як матеріал розвели до потрібної міри, розріджують вміст чотирьох пробірок зі звичайним поживним агаром для бактерій, скип'ятивши його на водяній бані й давши охолонути до 60 °C (до температури руки). За водяну баню надається хімічний стакан на 600 мл, наполовину наповнений водою. Вийміть ватний корок із пробірки й внесіть 1 мл передостаннього ступеня розведення матеріалу за стерильних умов піпеткою в ще рідке поживне середовище. Перемішайте вміст пробірки, покотивши пробірку між долонями.
Змішування проб
Складання та хід роботи (4/10)
Інкубування
Обпаліть отвір пробірки в полум'ї газового пальника й вилийте вміст у стерильну чашку Петрі. Так само засійте другу пробірку зі стандартним поживним агаром для бактерій із тим самим ступенем розведення й дві інші пробірки з останнім ступенем розведення досліджуваного матеріалу. Вилийте їхній вміст в окремі чашки Петрі. Підпишіть чашки (вид матеріалу, ступінь розведення, дата) і витримайте їх за 30 °C у термостаті.
Метод мембранної фільтрації
Визначення кількості мікроорганізмів методом мембранної фільтрації ґрунтується на накопиченні мікроорганізмів із відомої кількості матеріалу проби, напр. води чи ґрунту, на поверхні фільтра та їх подальшому мікроскопічному або культуральному виявленні. Використовуваний для цього мембранний фільтр складається з каркасної речовини на основі естерів целюлози та регенерованих целюлозних волокон. Ці речовини утворюють багатошарову систему порожнин і своїм розміром пор забезпечують затримання мікроорганізмів. Щоб профільтрувати матеріал проби, мембранний фільтр вставляють у прилад для мембранної фільтрації.
Складання та хід роботи (5/10)
Метод мембранної фільтрації (1/2)
Для збирання фільтрату використовують колбу для фільтрування, з'єднану через вакуумний шланг із водоструминним насосом. Гумовий корок, який пасує до шийки колби для фільтрування (1) і має відповідний отвір (2), насувають на зливну трубку нижньої частини приладу для мембранної фільтрації (3). Попередньо нанесіть трохи гліцерину на зливну трубку й на отвір гумового корка, щоб змастити їх. Вставте гумовий корок разом із нижньою частиною приладу для мембранної фільтрації в шийку колби для фільтрування й додайте порцелянову фритту (4) вбудованим синім ущільненням донизу. Далі на порцелянову фритту кладуть мембранний фільтр (5) рифленим боком догори. Закріпіть верхню частину приладу для мембранної фільтрації (6), яка має вміщувати матеріал проби, і з'єднайте верхню частину з нижньою за допомогою металевого затискача (7). Наостанок колбу для фільтрування під'єднують вакуумним шлангом до водоструминного насоса. Налийте матеріал проби, напр. пробу води, у верхню частину приладу для мембранної фільтрації, увімкніть водоструминний насос і профільтруйте пробу. Кількість, яку слід профільтрувати, залежить від передбачуваної концентрації мікроорганізмів у пробі.
Складання та хід роботи (6/10)
Метод мембранної фільтрації (2/2)
Для забарвлення відфільтрованих мікроорганізмів вийміть мембранний фільтр із приладу й дайте йому висохнути на повітрі. Поклади три круглі фільтри діаметром 90 мм у чашку Петрі діаметром 100 мм. Їх притискають, щоб вони щільно прилягали до дна чашки, і просочують водним розчином метиленового синього. Круглі фільтри мають бути вологі, проте слід стежити, щоб розчин барвника не утворював калюжок на папері. Покладіть висушений на повітрі мембранний фільтр покритим боком догори на 10 хвилин на круглі фільтри, просочені розчином барвника. За цей час розчин барвника проникає в мембранний фільтр і забарвлює фільтр разом із зібраними мікроорганізмами в темно-синій колір. Оскільки забарвитися мають лише мікроорганізми, мембранний фільтр після цього переносять у другу чашку Петрі на три шари круглих фільтрів, просочених дистильованою водою. У такий спосіб барвник вимивається з мембранного фільтра. Продовжуйте видаляти барвник, кілька разів замінюючи круглі фільтри, доки з мембранного фільтра більше не вимиватиметься барвник. Після цього даєш йому висохнути на повітрі. Після того як усе пройшло крізь прилад, мікроорганізми, що лишилися на фільтрі, фіксують, наливши у верхню частину приладу для мембранної фільтрації 10 мл 10 % розчину формальдегіду й профільтрувавши його. Далі весь прилад промивають, профільтрувавши 50-100 мл дистильованої води.
Складання та хід роботи (7/10)
Мікроскопічний аналіз мікроорганізмів
Мікроскопічний аналіз дає лише грубе орієнтування щодо кількості мікроорганізмів у матеріалі проби з точністю до порядку величини. Проте для учнівських дослідів цього методу, залежно від поставленого питання, часто досить. Щоб виконати мікроскопічний аналіз, виріжте з мембранного фільтра невеликі шматочки з довжиною ребра бл. 5 мм. Помістіть їх у краплю імерсійної олії або гліцерину на предметне скло, завдяки чому вони стануть прозорими, накрийте накривним склом і роздивіться за мікроскопічного збільшення 400 і 1000 разів. Під мікроскопом видно темно-сині мікроорганізми на білуватому, світлому або злегка синюватому тлі.
Для обробки результатів підрахуйте мікроорганізми на поле зору в кількох ділянках препарату й обчисліть середнє значення. Цим методом можна відносно порівнювати концентрацію мікроорганізмів у різному матеріалі проб, напр. у кількох пробах води. Проте абсолютне визначення кількості мікроорганізмів за допомогою мікроскопа неможливе. Крім того, він має ту ваду, що враховуються не лише живі мікроорганізми, важливі з гігієнічного погляду, а й мертві, які теж забарвлюються.
Складання та хід роботи (8/10)
Культуральний аналіз мікроорганізмів (1/3)
Якщо кількість мікроорганізмів треба визначити й порівняти не лише за порядком величини, а точно, то виявлення мікроорганізмів має бути культуральним, тобто через розвиток бактеріальних або грибних колоній. У такий спосіб враховуються лише життєздатні, тобто важливі з гігієнічного погляду мікроорганізми. Для цього треба дотримуватися строго стерильних умов. Це означає, що всі частини приладу для мембранної фільтрації, які контактують з матеріалом проби, мають бути простерилізовані. Інакше мікроорганізми, що на них тримаються, змиються на фільтр і спотворять результат випробування.
Спершу дійте так само, як і при мікроскопічному дослідженні мікроорганізмів. Проте після того, як ви поставили порцелянову фритту на нижню частину приладу для мембранної фільтрації, кілька разів і ретельно обпаліть фритту полум'ям газового пальника. Для культурального аналізу мікроорганізмів мембранні фільтри разом із поживними дисками постачають стерильно запакованими в поліетиленових пакетах.
Складання та хід роботи (9/10)
Культуральний аналіз мікроорганізмів (2/3)
Пінцетом, простерилізованим у полум'ї, вийміть мембранний фільтр і покладіть його на простерилізовану порцелянову фритту. Потім ретельно обпаліть внутрішній бік верхньої частини приладу для мембранної фільтрації, закріпіть її з порцеляновою фриттою на нижній частині й з'єднайте обидві частини за допомогою металевого затискача. Матеріал проби, напр. пробу води, внесіть у прилад для мембранної фільтрації й відберіть за допомогою водоструминного насоса. Залежно від передбачуваної концентрації мікроорганізмів може знадобитися розвести матеріал проби за стерильних умов, як і при розливі на чашках за Кохом.
Після того як усе пройшло крізь прилад, обполосніть внутрішній бік верхньої частини мембранного приладу стерильною дистильованою водою, щоб перенести мікроорганізми, які тримаються на стінках, на мембранний фільтр. Цю воду теж треба профільтрувати, відсмоктавши її водоструминним насосом. Пінцетом, простерилізованим у полум'ї, візьміть поживний диск зі стерильної упаковки й покладіть його в стерильну чашку Петрі діаметром 100 мм, наповнену 5 мл стерильної дистильованої води, яку внесли в чашку стерильною піпеткою. Диск фільтрувального паперу, з'єднаний із поживним диском, має бути повернений донизу.
Складання та хід роботи (10/10)
Налаштування та порядок дій (10/10)
Культуральний аналіз мікроорганізмів (3/3)
Чашки Петрі стерилізують у сушильній шафі гарячим повітрям. Те саме стосується піпеток, або ж їх стерилізують у спирті й потім обпалюють. Дистильовану воду наливають у пробірки, закриті ватними корками, або в колби Ерленмеєра. Після цього її стерилізують в автоклаві. Вийміть мембранний фільтр за допомогою простерилізованого в полум'ї пінцета з приладу для мембранної фільтрації й покладіть його на просочений стерильною дистильованою водою поживний диск. Стежте, щоб між мембранним фільтром і поживним диском не лишилося бульбашок повітря. Відкривайте чашку Петрі лише ненадовго для окремих робочих кроків, а решту часу тримайте її закритою, щоб культура не могла забруднитися мікроорганізмами з повітря. Відкриваючи чашку Петрі, піднімайте кришку лише трохи й завжди тримайте її над поверхнею чашки. Витримуйте чашку Петрі з поживним диском і мембранним фільтром за 30 °C у термостаті. Поживні речовини поживного диска розчиняються доданою дистильованою водою. Вони потрапляють дифузією на поверхню мембранного фільтра. Мікроорганізми, які там накопичилися, розмножуються, якщо запропоновані поживні речовини їм підходять. Протягом трьох-п'яти днів вони утворюють бактеріальні та грибні колонії, помітні неозброєним оком. Число життєздатних мікроорганізмів у профільтрованому матеріалі проби визначають потім підрахунком колоній.
Протокол
Завдання 1
Перетягніть слова у правильні поля Кількість мікроорганізмів - це ____ ____ мікроорганізмів в одному мілілітрі або грамі досліджуваного матеріалу, напр. води, ґрунту, молока, морозива тощо. Вона має велике практичне значення для аналізу ____, ґрунту та харчових продуктів. Кількість мікроорганізмів можна визначити точно лише тоді, коли всі пов'язані з цим роботи виконують так, щоб досліджуваний матеріал не був ____ сторонніми ____.
Завдання 2
Доповніть пропущені слова 1 позначають як ____. 2 називають ____. Він має отвір для (3) ____. 4 позначають як ____. Далі йде (5) ____. 6 позначають як верхню частину ____. Вона з'єднана з нижньою частиною ____.
Завдання 3
Питання