Основні методи роботи в мікробіології

Складання досліду

Історія мікроорганізмів починається з винайдення мікроскопа на початку XVII століття. Згодом Луї Пастер заклав перші важливі методи роботи з бактеріями. Роберт Кох зробив мікробіологію придатною для медицини. Його методи - основа сучасної мікробіологічної роботи, наприклад використання агару.

Цей дослід слугує для набуття базових знань про поводження з мікроорганізмами.

Попередні знання

Щоб запобігти забрудненню поживних середовищ і культурмікроорганізмами, які осідають наробочомуобладнанні, саме обладнання, поживні середовища та поживнірозчини потрібно стерилізувати.

Принцип

Поживне середовище розливають у чашки або з пробірок, коли одна пробірка містить потрібну кількість готового середовища на одну чашку Петрі, або з колб Ерленмеєра, якщо треба одночасно приготувати велику кількість чашок.

Навчальна мета

Завдання

Учні мають набути знань про основні прийоми роботи, характерні саме для мікробіологічних досліджень.

Учениці та учні мають опанувати такі прийоми роботи:

1. Стерилізація обладнання

2. Приготування стандартного поживного агару для бактерій

3. Приготування стандартного поживного агару для цвілевих грибіві дріжджів

4. Приготування стандартного поживного розчину длябактерій

5. Приготування пробірок зі скошеним агаром

6. Посів мікроорганізмів

Для цього досліду діють загальні правила безпечного експериментування на уроках природничих наук.

Історія мікроорганізмів починається з винайдення мікроскопа на початку XVII століття. Згодом Луї Пастер заклав перші важливі методи роботи з бактеріями. Роберт Кох зробив мікробіологію придатною для медицини. Його методи - основа сучасної мікробіологічної роботи, наприклад використання агару.

Мета цього досліду - набути базових знань для роботи з мікроорганізмами.

Складання досліду

Відпрацюйте такі прийоми роботи:

1. Стерилізація обладнання

2. Приготування стандартного поживного агару для бактерій

3. Приготування стандартного поживного агару для цвілевих грибіві дріжджів

4. Приготування стандартного поживного розчину длябактерій

5. Приготування пробірок зі скошеним агаром

6. Посів мікроорганізмів

Прилади мають бути стерильними, щоб уникнути забруднення. Металеві інструменти стерилізують у полум'ї газового пальника. Бактеріологічні петлі та голки перед використанням і після нього прожарюють у полум'ї газового пальника до червоного жару, а потім дають охолонути. Тримач обпалюють, якщо він може торкнутися культур або стерильних приладів. Дрібні скляні предмети, як-от предметні та накривні скельця, теж стерилізують обпалюванням. Перед обпалюванням їх можна занурити в 96-відсотковий етиловий спирт. Під час цієї операції предметні та накривні скельця слід тримати пінцетом. Піпетки стерилізують так: двічі-тричі наповнюють їх 96-відсотковим етиловим спиртом, дають спиртові витекти, залишок етилового спирту видувають у полум'я газового пальника, а потім кілька разів проводять піпетку крізь полум'я. Усі інші скляні частини обладнання нагрівають у повітряному стерилізаторі до 160 °C протягом 1 - 1½ години. Небезпека розтріскування менша, бо вони можуть охолоджуватися повільніше. Тому скляний посуд завжди ставлять у холодний стерилізатор, де він після стерилізації так само й охолоджується.

Поживне середовище складають так, щоб воно відповідало потребам цільових організмів - у цьому разі бактерій. Як драгле утворювач використовують агар-агар або короткий агар. На відміну від желатину, агар здатні розкладати лише кілька видів бактерій. Зважте потрібні кількості всіх складників, помістіть їх у хімічний стакан і кип'ятіть, доки агар повністю не розчиниться. Стакан має бути достатньо великим, щоб умістити чотирикратний об'єм приготованого середовища, бо агар легко збігає. Щойно розчин закипить, зменште полум'я і кілька разів перемішайте розчин. Зважте м'ясний екстракт. Для цього розкачують скляну паличку по предметному склу (рисунок на наступному слайді) і змивають м'ясний екстракт у стакан. Предметне скло можна також прокип'ятити разом із розчином і потім вийняти.

Зважування м'ясного екстракту

Поживне середовище має містити: м'ясний екстракт за Лібіхом 0,3 %; пептон 0,5 %; агар 2,0 %; як розчинник використовують дистильовану воду.

Коли всі складники повністю розчинилися, поживне середовище доводять до pH 7,4 - 7,6, додаючи краплями 1-відсотковий розчин натрій гідроксиду. При цьому перевіряйте pH pH-тест-смужками (pH 6,5 - 10,0). Бактерії найкраще ростуть у нейтральному чи слабколужному середовищі, тобто за pH близько 7,0 - 7,2. Оскільки концентрація йонів Гідрогену під час стерилізації поживного середовища дещо зменшується, її від початку встановлюють вищою за власне бажане значення. Приготоване поживне середовище потім розливають у пробірки; приблизно 12 - 15 мл (приблизно наполовину) для розливання чашок.

Слизовик

Цвілеві гриби й дріжджі ростуть переважно на слабкокислих субстратах, що слід урахувати, готуючи поживні середовища. Середовище має містити: сироп (буряковий сік) 5,0 %; агар 2,0 %; як розчинник використовують дистильовану воду. Помістіть потрібні кількості всіх складників у хімічний стакан і дійте так само, як для бактеріального середовища. Коли всі складники розчинилися, перевірте pH поживного середовища тест-смужкою. Він має становити приблизно 5,0 - 6,0. Якщо pH відхиляється від цього орієнтовного значення, додайте краплями 1-відсотковий розчин натрій гідроксиду або 1-відсоткову хлоридну кислоту. Приготоване поживне середовище потім розливають у пробірки; приблизно 12 - 15 мл (приблизно наполовину) для розливання чашок і 5 - 6 мл (приблизно на чверть) для приготування пробірок зі скошеним агаром. Більші кількості, які можна використати за один раз для розливання чашок, наливають у колби Ерленмеєра. Закрийте пробірки та колби Ерленмеєра стерильними корками і простерилізуйте їх в автоклаві. Більшість дріжджів і цвілевих грибів добре росте на такому поживному середовищі. Так само дійте, щоб приготувати поживні середовища іншого складу для дріжджів і цвілевих грибів.

Настільний автоклав

Складники поживних середовищ і розчинів, а також інструменти та прилади, якими їх готують, забруднені безліччю мікроорганізмів, які швидко розмножуються і зіпсували б приготовані поживні середовища. Щоб позбутися забруднення, їх поміщають в автоклав і стерилізують проточною парою. Повітряні стерилізатори для поживних середовищ і розчинів не годяться, бо вміст води в них зменшився б, а отже, зросла б концентрація поживних речовин.

Автоклави - це парові посудини, які можна герметично закрити. Вони дають змогу стерилізувати під надлишковим тиском і за температур понад 100 °C, завдяки чому гинуть і спори бактерій. Однак час знищення значною мірою залежить від насиченості пари в автоклаві.

Тому слід подбати, щоб після початку кипіння води в автоклаві вийшло якомога більше повітря - це дає високу насиченість пари. Автоклав треба наповнити потрібною кількістю води - зазвичай трохи нижче вкладки - а потім покласти предмети, які стерилізують. Кілька пробірок ставлять групою в контейнер. Установіть умови стерилізації 1,4 - 2,7 бар, приблизно 125 - 140 °C; після того як вода в автоклаві закипіла, про що свідчить вихід пари з випускного клапана, потримайте випускний клапан відкритим ще 3 хвилини, доки автоклав не звільниться від повітря, а тоді закрийте його. Через зростання тиску тепер досягається робочий тиск, і пара виходить із стерилізаційного клапана. Це означає, що впродовж усього часу стерилізації має виходити трохи пари. Після досягнення високого тиску 1,4 бар тривалість стерилізації становить 20 хвилин, або 15 хвилин за 2,7 бар. Після стерилізації дайте вмісту охолонути в автоклаві. З відкриванням автоклава зачекайте, доки високий тиск не спаде, щоб ніщо зі стерилізованого не википіло з посудини. Тоді зніміть кришку.

Чашки Петрі, наповнені затверділим поживним середовищем, називають чашками з середовищем. Поживне середовище розливають у чашки або з пробірок, коли одна пробірка містить потрібну кількість готового середовища на одну чашку Петрі. Пробірки з поживним середовищем мікробіологи називають просто трубками. Щоб можна було будь-коли розлити чашки, варто мати запас пробірок із готовим поживним середовищем. Пробірки з поживним агаром кип'ятять на водяній бані, доки їхній вміст не розрідиться. Пробірки з поживним желатином нагрівають на водяній бані, доки желатин не стане рідким. Після того як поживне середовище розрідилося, беруть пробірку з водяної бані і виймають ватний корок. Тоді ненадовго обпалюють горловину пробірки в полум'ї газового пальника, щоб усунути можливі забруднення (верхній рисунок на наступному слайді)

Відкрийте кришку стерильної чашки Петрі діаметром 100 мм настільки, щоб горловина пробірки пройшла між верхньою і нижньою частинами, не торкаючись їх. Тоді вилийте поживне середовище з пробірки в чашку Петрі (нижній рисунок) і одразу поверніть кришку на місце. Під час розливання верхня частина чашки Петрі має якомога повніше накривати нижню, щоб у чашку не потрапили мікроорганізми з повітря. Зробіть закритою чашкою Петрі коловий рух по стільниці, щоб рівномірно розподілити поживне середовище по всій поверхні чашки. Потім залиште чашку в спокої, доки поживне середовище не затвердіє.

Розливаючи чашки з колб Ерленмеєра, діють так само. Чашки, які не використовують одразу, можна певний час зберігати в холодильнику кришкою донизу, тобто догори дном.

Пробірки зі скошеним агаром - це пробірки, у яких поживне середовище затверділо з похилою поверхнею. Завдяки цьому для посіву доступна більша поверхня поживного середовища. Оскільки вони досить компактні, у серіях дослідів їх часто використовують замість чашок. Крім того, чисті культури мікроорганізмів зберігають для колекцій саме на пробірках зі скошеним агаром, якщо умови культивування це дозволяють. Приготуйте потрібне поживне середовище, налийте по 5 - 6 мл у кілька пробірок (приблизно на чверть), закрийте їх стерильними корками і простерилізуйте. Одразу після цього, доки поживне середовище ще рідке, поставте верхній кінець пробірок на дерев'яну планку заввишки приблизно 12 - 15 мм. Для цього чудово підходить і трубка газового пальника, бо має ідеальний діаметр (рисунок угорі ліворуч). Завдяки цьому поживне середовище затвердіє в пробірках, утворивши довгу похилу поверхню. Поживне середовище має сягати приблизно початку верхньої третини пробірки.

Під час посіву мікроорганізмів важливо, щоб поживні середовища чи культури не забруднилися сторонніми мікроорганізмами. Не ходіть по приміщенню під час посіву, щоб уникнути зайвого руху повітря. Щоб очистити й простерилізувати бактеріологічну петлю, обпаліть її в полум'ї газового пальника до червоного жару. Потім дайте їй охолонути. Беручи мікроорганізми з пробірки, обережно витягніть ватний корок тією рукою, яка тримає петлю. Тримайте корок у цьому положенні (верхній рисунок на наступному слайді), доки не вставите його назад у пробірку. Ненадовго обпаліть відкриту горловину пробірки полум'ям газового пальника. Обережно введіть петлю в пробірку, візьміть трохи культури, ще раз обпаліть горловину пробірки і вставте ватний корок назад. Після цього перенесіть посівний матеріал на нове поживне середовище або в нього.

Якщо треба засіяти пробірку зі скошеним агаром, то відкривати пробірку слід так само, як і під час відбору посівного матеріалу. Переносячи в поживні розчини, масу мікроорганізмів обережно розподіляють по скляній стінці трохи нижче поверхні рідини, щоб вона якомога рівномірніше розійшлася в поживному розчині. Якщо треба засіяти чашки, їх ставлять кришкою донизу, тобто догори дном. Тоді підніміть нижню частину, переверніть її, розподіліть посівний матеріал і покладіть нижню частину назад на кришку. Так само дійте, коли берете матеріал із чашки, на якій виросли мікроорганізми.

На всіх видах поживних середовищ посівний субстрат зазвичай розподіляють зигзагом (верхній рисунок), щоб якнайкраще використати доступну площу середовища. Після посіву петлю одразу обпалюють у полум'ї газового пальника до червоного жару, щоб очистити й простерилізувати її. Обпаліть тримач настільки, наскільки він стикався з посівним матеріалом.

.