Субстрат інгібування ферментів з Cobra SMARTsense

Експериментальна установка

Більш детальна інформація про результати

• Високий надлишок субстрату призводить до оборотного інгібування ферментів, тобто швидкість реакції більше не збільшується при збільшенні концентрації субстрату, а залишається постійною або навіть знижується, оскільки молекули субстрату взаємодіють одна з одною в просторі ("інгібування субстрату").
• Для оцінки середня швидкість ензимолізу визначається між 100 і 200 с після початку експерименту. Слід розрахувати різницю між значеннями електропровідності через 100 і 200 с і розділити на 100 с . Потім визначають швидкість ферментативного розщеплення. Ці швидкості (у мкСм/cмс) наносять на графік в залежності від концентрації сечовини (у ммоль/л). Концентрація субстрату (у ммоль/л) визначається за формулою: ,

де концентрація розчину сечовини в% і молярна маса сечовини = 60,06 г / моль.

Інструкції з техніки безпеки

Ферментативний гідроліз сечовини у водному розчині призводить до утворення вуглекислого газу та аміаку. Іони цих сполук збільшують електропровідність розчину. Вимірювання електропровідності можна використовувати для визначення швидкості гідролізу сечовини ферментом уреазою при різних концентраціях субстрату. При надмірній концентрації субстрату відбувається його інгібування.

Субстратне інгібування є оборотним, тобто його можна повернути назад. Інгібування субстратом також характеризується тим, що швидкість реакції більше не зростає зі збільшенням концентрації субстрату, а зупиняється на певному значенні.

Підготовка (1/5)

Для вимірювання за допомогою датчиків Cobra SMARTsense необхідне додаток PHYWE measureAPP. Цей застосунок можна безкоштовно завантажити з відповідного магазину додатків (QR-коди дивіться нижче). Перед запуском додатка, будь ласка переконайтеся, що на Вашому пристрої (смартфоні, планшеті, персональному комп'ютері) активовано Bluetooth.

Підготовка (2/5)

Підготовка (3/5)

Для проведення експерименту потрібні розчини з різними концентраціями сечовини. Вони мають бути свіжоприготовані перед початком експерименту:

• 1,6% розчин сечовини (основний розчин сечовини): Відміряйте 2 г сечовини в мензурку об'ємом 250 мл і розчиніть у 123,00 г дистильованої води.
• 0,8 % розчин сечовини: Перенесіть 50 мл 1,6 % розчину сечовини мірною піпеткою об'ємом 50 мл у колбу Ерленмейєра об'ємом 100 мл і додайте 50 мл дистильованої води.
• 0,4% розчин сечовини: Перенесіть 50 мл 0,8% розчину сечовини мірною піпеткою об'ємом 50 мл у колбу Ерленмейєра об'ємом 100 мл і додайте 50 мл дистильованої води.
• 0,2% розчин сечовини: Перенесіть 50 мл 0,4% розчину сечовини мірною піпеткою об'ємом 50 мл у колбу Ерленмейєра об'ємом 100 мл і додайте 50 мл дистильованої води.

Підготовка (4/5)

• 0,1% розчин сечовини: Перенесіть 50 мл 0,2% розчину сечовини мірною піпеткою об'ємом 50 мл у колбу Ерленмейєра об'ємом 100 мл і додайте 50 мл дистильованої води.
• 0,05 % розчин сечовини: Перенесіть 50 мл 0,1 % розчину сечовини мірною піпеткою об'ємом 50 мл у колбу Ерленмейєра об'ємом 100 мл і додайте 50 мл дистильованої води.
• 0,025 % розчин сечовини: Перенесіть 50 мл 0,05 % розчину сечовини мірною піпеткою об'ємом 50 мл у колбу Ерленмейєра об'ємом 100 мл і додайте 50 мл дистильованої води.
• 0,0125 % розчин сечовини: Перенесіть 50 мл 0,025 % розчину сечовини мірною піпеткою об'ємом 50 мл у колбу Ерленмейєра об'ємом 100 мл і додайте 50 мл дистильованої води.

Примітка: розчин сечовини завжди слід зберігати у холодильнику!

Підготовка (5/5)

• Додайте 40 мл 0,0125% розчину сечовини (спочатку найнижча концентрація) до мензурки об'ємом 100 мл шляхом подвійного піпетування за допомогою мірної піпетки об'ємом 20 мл, потім помістіть у мензурку стрижень для магнітної мішалки.
• Поставте мензурку на магнітну мішалку і занурте датчик SMARTsense-Електропровідність (Cobra SMARTsense Conductivity) в розчин.
• Встановіть мішалку на середню швидкість перемішування. (Увага: стрижень магнітної мішалки не повинен торкатися датчика!).
• За допомогою мікролітрового шприца додайте 50 мкл розчину уреази й одразу почніть вимірювання, натиснувши кнопку "Пуск".
• Після завершення вимірювання збережіть дані для подальшої обробки.

• Таким самим чином проводяться вимірювання з усіма вісьмома приготованими розчинами сечовини (у порядку зростання).
• Для проведення окремих вимірювань склянку знімають з магнітної мішалки в кожному випадку, а стрижень магнітної мішалки виймають з розчину за допомогою знімача.
• Стрижень магнітної мішалки необхідно ретельно промити дистильованою водою, ненадовго просушити паперовим рушником, а потім помістити в наступний розчин.
• Після кожного експерименту датчик SMARTsense-Електропровідність (Cobra SMARTsense Conductivity) слід промити дистильованою водою.

Щоб визначити концентрацію, з якої починається інгібування субстратом, визначають значення електропровідності в моменти часу 100 с і 200 с, їхню різницю та записують для всіх восьми проведених вимірювань.