Загальна інформація
Опис
Під час ферментативного гідролізу сечовини (карбаміду) у водному розчині отримують вуглекислий газ та аміак. Іони цих сполук збільшують провідність розчину. Вимірювання електропровідності можуть бути використані для визначення швидкості гідролізу сечовини ферментом уреази за різних концентрацій субстрату. Константа Міхаеліса може бути розрахована на основі цих значень.
Експериментальна установка
Додаткова інформація (1/7)
Попередні
знання
Учні та студенти мають бути знайомі з ферментно-субстратними комплексами, ферментативним гідролізом сечовини та принципом вимірювання електропровідності.
Принцип
Константа Міхаеліса обчислюється на основі вимірювань провідності.
Додаткова інформація (2/7)
Мета навчання
Учні та студенти мають дізнатися, як можна розрахувати константу Міхаеліса шляхом визначення провідності (шляхом гідролізу сечовини, що постачає вуглекислий газ та аміак).
Завдання
Учні та студенти мають визначити константу Міхаеліса за виміряними значеннями, визначеними в цьому експерименті.
Додаткова інформація (3/7)
Додаткова інформація про оцінку та підготовку
- Для визначення константи Міхаеліса визначаються і записуються значення електропровідності в моменти часу 100 с і 200 с та їх різницю для всіх шести виконаних вимірювань.
- Механізм ферментативних реакцій за Міхаелісом-Ментеном передбачає наявність фермент-субстратного комплексу , який утворюється з ферменту і субстрату у висхідній рівноважній реакції і розпадається на продукт і незмінений фермент .
Згідно з принципом Боденштейна, зміна концентрації протягом часу дорівнює .
Додаткова інформація (4/7)
Після перетворення з урахуванням концентрації отримуємо:
Концентрація вільного субстрату може бути прирівняна до загальної концентрації оскільки додається тільки трохи ферменту. Загальна концентрація дорівнює сумі концентрацій вільного ферменту і фермент-субстратного комплексу :
Після перетворення і заміни рівняння (4) у рівняння (3) отримуємо:
Таким чином, перехід на забезпечує:
Додаткова інформація (5/7)
Етап формування продукту має такий закон часу:
Підставивши вираз (6) замість , отримуємо:
Коефіцієнт
разом утворюють сталу Міхаеліса . Отже, закон часу має вигляд:
Таким чином, швидкість ензимолізу лінійно залежить від концентрації ферменту. Вплив концентрації субстрату концентрації субстрату є більш складним. У випадку > рівняння (10) спрощується до:
Додаткова інформація (6/7)
У цьому випадку реакція нульового порядку і ензимоліз (ферментоліз) має максимальну швидкість при . Якщо , досягається половина максимальної швидкості. Таким чином, константа Міхаеліса відповідає концентрації субстрату, за якої реакція протікає на половині максимальної швидкості. У разі, якщо субстрату залишилося зовсім небагато, тобто це призводить до рівняння:
тобто швидкість утворення є першим порядком після та .
Для оцінки середня швидкість ензимолізу визначається між 100 і 200 с після початку експерименту. Слід розрахувати різницю між значеннями електропровідності через 100 і 200 с і розділити на 100 с . Потім визначають швидкість ферментативного розщеплення (лізису). Ці швидкості (у мкСм/cмс) наносять на графік в залежності від концентрації сечовини (у ммоль/л). Концентрація субстрату (у ммоль/л) визначається за формулою:
(13),де концентрація розчину сечовини в% і молярна маса сечовини = 60,06 г / моль.
Додаткова інформація (7/7)
Оскільки важко безпосередньо зчитувати концентрацію, що відповідає половині максимальної швидкості, тобто , використовується графік Лайнвівера-Берка.
При швидкості реакції і у зворотному поданні з рівняння (10) отримуємо:
Графік залежності відносно (див. рис. 5), таким чином, дає (у ступені -1) як перетин ординати і / як нахил прямої лінії. Спочатку визначається перетин ординати і нахил прямої. Потім цей нахил ділиться на точку перетину ординат, щоб отримати константу Міхаеліса. Розрахунок дає значення моль/л для константи Міхаеліса уреази.
Невелике значення означає, що фермент має високу спорідненість до свого субстрату. Уреаза була першим ферментом, представленим у кристалічній формі (Самнер, 1926). На відміну від алостеричних ферментів, він належить до "нормальних" ферментів, що задовольняють механізму Міхаеліса-Ментена.
Правила техніки безпеки
Інструкції з техніки безпеки
- До цього експерименту застосовуються загальні інструкції щодо безпечного проведення експериментів під час викладання природничих наук.
Теорія
Уреаза каталізує ферментативний гідроліз сечовини у воді, забезпечуючи тим самим діоксид вуглецю і воду. За допомогою датчика провідності SMARTsense можна виміряти електропровідність отриманого розчину. Це дає змогу простежити, як іони в сполуці збільшують електропровідність.
Константа Міхаеліса вказує концентрацію субстрату, за якої досягається половина максимальної швидкості ферменту.
Оскільки швидкість гідролізу сечовини за різних концентрацій субстрату може бути визначена шляхом вимірювання провідності, константа Міхаеліса може бути розрахована на основі цих значень.
Обладнання
Додаткове обладнання
Додаткові матеріали
| Позиція | Номер артикля | Матеріали |
|---|---|---|
| 1 | мобільний пристрій (смартфон/планшет) | |
| 2 | 14581-61 | measureAPP |
Підготовка та виконання роботи
Підготовка (1/5)
Для вимірювання за допомогою датчиків Cobra SMARTsense необхідне додаток PHYWE measureAPP. Цей застосунок можна безкоштовно завантажити з відповідного магазину додатків (QR-коди дивіться нижче). Перед запуском додатка, будь ласка переконайтеся, що на Вашому пристрої (смартфоні, планшеті, персональному комп'ютері) активовано Bluetooth.
iOS
Android
Windows
Підготовка (2/5)
Структура (2/5)
measureApp
у версії Windows 10
- Увімкніть датчик електропровідності SMARTsense, натиснувши й утримуючи кнопку живлення.
- Підключіть датчик до пристрою в застосунку measureAPP у розділі "Вимірювання", як показано на рисунку ліворуч.
- Датчик електропровідності SMARTSense тепер відображається в застосунку.
Підготовка (3/5)
Для проведення експерименту потрібні розчини з різними концентраціями сечовини. Вони мають бути свіжоприготовані перед початком експерименту:
- 0,4% розчин сечовини (основний розчин сечовини): 0,40 г сечовини відміряють у колбу Ерленмейєра об'ємом 100 мл і розчиняють у 99,6 г дистильованої води.
- 0,2% розчин сечовини: Перенесіть 50 мл 0,4% розчину сечовини мірною піпеткою об'ємом 50 мл у колбу Ерленмейєра об'ємом 100 мл і додайте 50 мл дистильованої води.
- 0,1% розчин сечовини: Перенесіть 50 мл 0,2% розчину сечовини мірною піпеткою об'ємом 50 мл у колбу Ерленмейєра об'ємом 100 мл і додайте 50 мл дистильованої води.
- 0,05 % розчин сечовини: Перенесіть 50 мл 0,1 % розчину сечовини мірною піпеткою об'ємом 50 мл у колбу Ерленмейєра об'ємом 100 мл і додайте 50 мл дистильованої води.
Підготовка (4/5)
- 0,025 % розчин сечовини: Перенесіть 50 мл 0,05 % розчину сечовини мірною піпеткою об'ємом 50 мл у колбу Ерленмейєра об'ємом 100 мл і додайте 50 мл дистильованої води.
- 0,0125 % розчин сечовини: Перенесіть 50 мл 0,025 % розчину сечовини мірною піпеткою об'ємом 50 мл у колбу Ерленмейєра об'ємом 100 мл і додайте 50 мл дистильованої води.
Примітка: розчин сечовини завжди слід зберігати у холодильнику!
Підготовка (5/5)
- Зберіть експериментальну установку, як показано на рисунку.
- Закріпіть універсальний затискач на штативному стрижні підставки Бунзена за допомогою подвійної муфти.
- Закріпіть датчик SMARTsense-Електропровідність (Cobra SMARTsense Conductivity) універсальним затискачем.
Виконання роботи (1/2)
- Додайте 40 мл 0,0125% розчину сечовини (спочатку найнижча концентрація) до мензурки об'ємом 100 мл шляхом подвійного піпетування за допомогою мірної піпетки об'ємом 20 мл, потім помістіть у мензурку стрижень для магнітної мішалки.
- Поставте мензурку на магнітну мішалку і занурте датчик SMARTsense-Електропровідність (Cobra SMARTsense Conductivity) в розчин.
- Встановіть мішалку на середню швидкість перемішування. (Увага: стрижень магнітної мішалки не повинен торкатися датчика!).
- За допомогою мікролітрового шприца додайте 50 мкл розчину уреази й одразу почніть вимірювання, натиснувши кнопку "Пуск".
- За ходом реакції можна візуально стежити на моніторі.
- Після завершення вимірювання збережіть дані для подальшої обробки.
Виконання роботи (2/2)
- Таким самим чином проводять вимірювання з усіма шістьма приготованими розчинами сечовини (у порядку зростання).
- Для проведення окремих вимірювань склянку знімають з магнітної мішалки в кожному випадку, а стрижень магнітної мішалки виймають з розчину.
- Стрижень магнітної мішалки необхідно ретельно промити дистильованою водою, ненадовго просушити паперовим рушником, а потім помістити в наступний розчин.
- Після кожного експерименту датчик SMARTsense-Електропровідність (Cobra SMARTsense Conductivity) слід промити дистильованою водою.
Протокол
Завдання 1
Вставте слова в тексті в потрібне місце! При ферментативному гідролізі сечовини у водному розчині отримують ____ і аміак. ____ цих сполук збільшують ____ розчину. Вимірювання провідності можуть бути використані для визначення швидкості гідролізу сечовини ферментом ____ за різних концентрацій субстрату. ____ може бути розрахована на основі цих значень.
Завдання 2
Питання
Питання
Завдання 3
Питання